IL-8及IL-8 mRNA在分娩期宫颈扩张过程中子宫下段肌层表达意义的研究

　　作者：李斌 ， 柯丽娜， 张有顺， 李金范， 林 虹 作者单位：郧阳医学院附属东风医院1妇产科，2实验中心，3病理科，湖北 十堰 442008

　　【摘要】 目 的: 观察白细胞介素-8(IL-8)及mRNA在分娩期宫颈不同扩张程度下的子宫下段肌层组织中的表达，探讨其在宫颈扩张机制中的作用。方法:收集标本共40例，根据宫颈扩张程度分为A组宫颈口开大<2 cm，B组宫颈口开大2~4 cm，C组宫颈口开大4~6 cm，D 组宫颈口开大>6 cm，每组各10例。应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术和免疫组织化学SP法分别测定各子宫下段肌层IL-8 mRNA及IL-8的表达。结果:IL-8 mRNA和其蛋白质在C组和D组的表达明显增强，均高于A组和B组(P<0.01)。结论:IL-8在宫颈扩张过程中子宫下段组织的表达增加，在宫颈扩张过程中起重要作用。

　　【关键词】 分娩

　　Interleukin-8 and interleukin-8 mRNA expression in the lower uterine segment during term parturition. LI Bin,KE Li-na, ZHANG You-sun,et aL.(Department of Obstetrics and Gynecology, DongFeng Hospital,Yunyang Medical College, Shiyan,Hubei 442008)

　　Abstract:Objective To determine the expression of Interleukin-8 mRNA and Interleukin-8(IL-8) in the lower uterine segment during parturition at term and to investigate its correlation with the stage of cervical dilatation. Methods Biopsy specimens were taken from the lower uterine segment of 40 women undergoing cesarean section at term .The stage of cervical dilatation at the time of cesarean section was < 2 cm (group A,n=10),2 to < 4 cm (group B,n=10), 4 to 6 cm (group C,n=10) or > 6 cm (group D,n=10).IL-8 mRNA expression was detected using reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR).The expression of IL-8 was measured by immunohistochemistry. Results:The expression of IL-8 mRNA and IL-8 were significantly greater at group C and group D than group A and group B (P<0.01).Conclusions Cervical dilatation is associated with up-regulation of IL -8 in the lower uterine segment.

　　Key words:Parturition;Interleukin-8;Cervix

　　人类宫颈是由大量胶原纤维、基质和水组成的结缔组织，含少量弹性纤维、平滑肌。妊娠晚期宫颈成熟、子宫下段形成和宫颈扩张是分娩的必要条件，但其机制尚不明确。目前国外有学者认为宫颈扩张类似于急性炎症反应[1]。促炎性细胞因子IL-8、TNF-α和粘附分子等在炎症反应中有重要作用，我们通过观察IL-8及mRNA在分娩期宫颈不同扩张程度下的子宫下段肌层组织中的表达，探讨其在宫颈扩张过程中的作用。

　　1资料与方法

　　1.1 一般资料2003年8月-2004年3月在我院住院分娩的足月单胎妊娠初产妇女40例，排除肝肾疾病、糖尿病、原发性高血压及其它心血管疾病、急慢性感染性疾病、自身免疫性疾病、胎膜早破及宫内感染性因素。手术前体温<37.4 ℃，白细胞记数<1.5 G/L，阴道细胞学检查示清洁度Ⅱ级以下[2]。根据肛查宫口开大程度分为A组：10例，宫颈口开大<2 cm;B组：10例，宫颈口开大2~4cm;C组：10例，宫颈口开大4 ~6 cm;D组：10例，宫颈开大> 6 cm。

　　1.2方法

　　1.2.1标本的采集及处理:每例孕妇在择期或急症剖宫产术中，在膀胱腹膜反折下1 cm处取子宫下段横切口，胎盘娩出前，于切口下缘中部的子宫壁取全层组织1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm，洗去血液和羊水，经液氮速冻，-80 ℃冰箱保存。

　　1.2.2RT-PCR检测IL-8 mRNA基因表达：①总RNA提取：应用异硫氰酸胍一步法提取总RNA。②RT-PCR：取总RNA提取物1 μl,25 nmol dNTP 2.5 μl ，RNAin 1 μl，引物各1 μl(IL-8引物：上游引物5' -AAGCTGGCCGTGGCTCTCTTG -3'，下游引物：5'- AGC CCT CTT CAA AAA CTT CTC -3')均由上海生工公司合成)，10*PCR Buffer 2.5 μl，25 mmol MgCl21.5 μl用DEPC水补足23 μl混匀,95 ℃×5 min后冰溶5 min，再加入MLV逆转录酶及Tag酶(均为Promaga产品)各1μl，合成cDNA，然后进行PCR。β-action反应条件同上。③PCR产物的鉴定和半定量进行2%琼脂糖电泳，紫外灯下可见IL-8为279 bp荧光条带，β-action为540 bp荧光条带，在紫外凝胶图象分析仪上进行荧光亮度测定，计算IL-8/β-action比值。

　　1.2.3IL-8的测定:恒冷冰冻切片(5 μm)，用免疫组织化学链霉素抗生物素(SP)法检测，其鼠抗人单克隆抗体为美国NeoMarkers公司产品，稀释度为1∶100。SP试剂盒购自福建迈新公司。手术摘除的子宫平滑肌瘤作IL-8阳性对照，磷酸盐缓冲液代替单克隆抗体作阴性对照，细胞核用苏木素复染。

　　1.3结果判定IL-8阳性细胞为细胞核染成棕黄色，有棕黄色颗粒, 在200倍镜下每张切片随机选取10个视野，每个视野内观察100个组织细胞，计算其中的阳性细胞数[3]，按阳性细胞的百分比，将其分为4个等级：无阳性细胞为无表达(-)，10%~24%为弱程度表达(+)，25%~75%为中等程度表达(++)，>75%为强程度表达(+++)。

　　1.4统计学方法采用F检验和Kruskal-Wallis秩和检验。IL-8 mRNA相对表达量用x±s表示(F检验)。

　　2 结果

　　2.1IL-8 mRNA的表达IL-8 mRNA在A组和B组的子宫下段组织上有微量表达，在C组和D组的表达明显增强。C组和D组IL-8 mRNA的相对表达量均明显高于A组和B组(P<0.01)，但A组与B组、C组与D组间比较均无显著性差异(P>0.05),见图1和表1。

　　2.2 IL-8的表达IL-8在平滑肌组织上表达，C组、D组平滑肌组织IL-8的表达明显高于A组和B组(P<0.01)，A组与B组、C组与D组间比较均无显著性差异(P>0.05),见图2和表1。表1 子宫下段肌层组织IL-8 mRNA相对表达量注：与A组比较：*P<0.01;与B组比较：▲P<0.01

　　3讨论

　　近年细胞因子在分娩中的作用被逐渐认识并加以深入研究。从受精卵植入到分娩，均有细胞因子产生，可由子宫组织中的单核细胞和巨噬细胞、子宫内膜细胞、蜕膜组织和胎盘组织细胞等产生。有研究[4]表明在足月妊娠和分娩过程中羊膜和绒毛膜细胞可产生约60多种细胞因子，其中促炎因子IL-1、IL-6、IL-8等对子宫的收缩性有一定的调节作用，与介导分娩发动有关。同时，这些促炎因子在分娩过程中胎膜、宫颈和子宫下段组织中的表达随着宫颈的扩张其表达逐渐增加，与宫颈扩张有关[2、4-6]。宫颈扩张是分娩过程中的必要条件之一。关于宫颈扩张机制的研究较少，普遍认为宫颈扩张是子宫收缩和缩复向上牵拉，胎先露压迫的机械刺激结果。目前，有学者研究发现宫颈扩张过程中有类似急性炎症反应的现象。

　　IL-8是由单核巨噬细胞产生的细胞因子，是中性粒细胞的化学趋动因子，可诱导中性粒细胞浸润至组织，并降解、脱颗粒，释放弹性蛋白酶、髓过氧化物酶、胶原酶等物质。许多研究表明IL-8与宫颈成熟和分娩发动密切相关。Kemp[2] 等报道随着宫颈的扩张，子宫下段组织IL-8浓度在宫颈扩张>4 cm后显著升高，用原位杂交技术发现在宫颈扩张>4 cm以后，IL-8 mRNA在子宫下段肌层血管和腺上皮细胞上有强表达。Maul[6]报道在宫颈扩张> 6 cm以后，子宫下段肌层组织IL-8 mRNA相对表达量明显高于宫颈扩张<2 cm组。Thomson [1、7]等证实在分娩过程中，子宫下段肌层中有中性粒细胞和巨噬细胞等白细胞浸润，中性粒细胞数目明显增加，并处于降解状态，可激活和释放蛋白酶、胶原酶等一系列酶，降解细胞外基质的必需结构蛋白，使宫颈易于扩张，宫颈扩张类似于急性炎症反应。本研究发现IL-8及其mRNA在C组和D组的表达明显增强，其相对表达量均显著高于A组和B组，提示IL-8在宫颈扩张过程中，可以通过趋动中性粒细胞，并使中性粒细胞降解、释放胶原酶，在宫颈扩张过程中起作用。本研究结果亦为宫颈扩张过程类似急性炎症反应的学说进一步提供了依据。

　　【参考文献】

　　[1] Thomson AJ,Telfer JF,Young A,et al.Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes,decidua,cervix and myometrium before and during labour at term[J].Hum Reprod,1999,14(1):229-236.

　　[2] Kemp B,Menon R,Fortunato SJ,et al.Quantitation and localization of inflammatory cytokines interleukin-6 and interleukin-8 in the lower uterine segment during cervical dilatation[J].J Assist Reprod Genet,2002,19(5):215-219.

　　[3]Pijnenborg R,McLaughlin PJ,Vercruysse L,et al.Immunolocalization of tumour necrosis factor-alpha (TNF-alpha) in the placental bed of normotensive and hypertensive human pregnancies[J].Placenta,1998,19(4):231-239.

　　[4]Sehringer B,Schafer WR,Wetzka B,et al.Formation of proinflammatory cytokines in human term myometrium is stimulated by lipopolysaccharide but not by corticotropin-releasing hormone[J].J Clin Endocrinol Metab,2000,85(12):4 859-4 865.

　　[5] Osman I,Young A,Ledingham MA,et al.Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes,decidua, cervix and myometrium before and during labour at term[J].Mol Hum Reprod,2003,9(1):41-45.

　　[6] Maul H,Nagel S,Welsch G,et al.Messenger ribonucleic acid levels of interleukin-1 beta,interleukin-6 and interleukin-8 in the lower uterine segment increased significantly at final cervical dilatation during term parturition,while those of tumor necrosis factor alpha remained unchanged[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2002,102(2):143-147.

　　[7] Winkler M,Rath W.Changes in the cervical extracellular matrix during pregnancy and parturition[J].J Perinat Med,1999,27(1):45-60.