子宫内膜癌错配修复基因ｈＭＬＨ１的表达和启动子甲基化研究

　　作者：舒珊荣， 柯佩琪， 李小毛， 李美香 王 莉， 费 慧 作者单位：中山大学 1. 附属第一医院妇产科; 2. 附属第三医院妇产科; 3. 肿瘤防治中心， 广东 广州 510630

　　【摘要】 【目的】 探讨子宫内膜癌组织中错配修复基因hMLH1 的表达和启动子甲基化状态与子宫内膜癌发生的关系。【方法】 应用免疫组化链霉素抗生物素- 过氧化物酶法(S-P法)和甲基化特异性聚合酶连反应(MSP)方法，检测37例子宫内膜癌组织和20例正常增生期子宫内膜组织中hMLH1蛋白的表达和启动子甲基化状态。【结果】 37例子宫内膜癌组织和20例正常增生期子宫内膜组织hMLH1基因蛋白表达分别为51.4%(19/37)，85%(17/20);基因启动子甲基化分别为43.2%(16/37)，15%(3/20)。发生甲基化的16例子宫内膜癌组织14例蛋白表达阴性，发生甲基化的3例正常增生期子宫内膜组织2例蛋白表达阴性。hMLH1蛋白表达与组织学分级(G1， G2， G3)有关，与肿瘤肌层浸润、淋巴结转移、国际妇产科协会(FIGO)分期和宫颈浸润无相关性，hMLH1的甲基化与上述临床病理因素均无相关性。【结论】 hMLH1基因启动子甲基化与其蛋白表达缺失密切相关，hMLH1基因在子宫内膜癌的发生过程中发挥重要作用。

　　【关键词】 子宫内膜癌; hMLH1基因; 表达; 启动子甲基化

　　Mismatch Repair Gene hMLH1 Expression and Promoter Methylation

　　in Endometrial Carcinoma

　　SHU Shan-rong1， KE Pei-qi1?鄢， LI Xiao-mao2， LI Mei-xiang3， WANG Li3， FEI Hui1

　　(1. Department Of Gynecology and Obstetrics， The First Affiliated Hospital;

　　2. Department Of Gynecology and Obstetrics， The Third Affiliated Hospital;

　　3. Cancer Center， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510630， China)

　　Abstract： 【Objective】 To explore the correlation between the mismatch repair gene hMLH1 protein expression and promoter methylation with endometrial carcinoma. 【Methods】 The protein expression of hMLH1 and the status of promoter methylation were detected by immunohistochemistry and methylation specific PCR (MSP) in the tissues of endometrial carcinoma and normal proliferative endometrium. 【Results】 The protein expression rate of hMLH1 was 51.4% (19/37) in endometrial carcinoma and 85%(17/20) in normal proliferative endometrium， respectively. The DNA methylation rate was 43.2%(16/37) and 15%(3/20)in endometrial carcinoma and normal proliferative endometrium， respectively. The hMLH1 was not expressed in 14 of 16 methylated cases of endometrial carcinoma and 2 of 3 methylated cases of normal proliferative endometrium. The protein expression of hMLH1 was correlated with histological grade (G1， G2， G3) of endometrial carcinoma. No correlation was found between muscular layer invasion， lymph metastasis， FIGO stage and cervical invasion with hMLH1 protein expression. hMLH1 methylation did not correlate with such clinicopathological characteristics. 【Conclusions】 hMLH1 methylation was associated with the absence of hMLH1 protein expression. The hMLH1 involved in carcinogenesis of endometrial carcinoma.

　　Key words： endometrial carcinoma; hMLH1 gene; expression; promoter methylation

　　近年来子宫内膜癌的发病率有所上升，其确切发病机理至今仍不十分清楚。随着分子生物学技术的发展和广泛应用，子宫内膜癌的分子遗传学特征已逐渐被人们所了解。目前普遍认为子宫内膜癌的发病是一个涉及多基因、多步骤的复杂过程。多个癌基因激活、抑癌基因失活的致癌模式逐渐为人们所认识。抑癌基因可通过突变和染色体缺失而失活，CpG岛甲基化也是肿瘤抑癌基因失活的途径之一。错配修复基因hMLH1是细胞内错配修复系统的重要组成部分，其功能缺失导致碱基错配不能得到有效的修复，突变累积，导致肿瘤的发生。研究发现hMLM1突变与卵巢癌、子宫内膜腺癌及胃癌均有关。同时，在多种散发性肿瘤中， hMLM1表达异常主要与启动子区CpG岛的高甲基化有关。甲基化特异性PCR克服了以往甲基化状态研究方法的局限性，即使肿瘤组织中混有正常组织也不完全影响结果，而且只需要很少量的DNA，具有简单、敏感、高效的特点。故本实验应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR)和免疫组化链霉素抗生物素-过氧化物酶染色法(S-P法)，检测子宫内膜癌及正常增生期子宫内膜组织hMLH1基因的DNA甲基化以及该基因蛋白的表达情况，旨在探讨hMLH1基因与子宫内膜癌发病机制的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　收集2004年3月 ～ 2006年10月在中山大学附属第一医院妇科住院手术治疗的子宫内膜癌患者37例，同期因子宫肌瘤住院行全子宫切除患者的正常的增生期子宫内膜组织20例，新鲜组织在离体后即放入液氮内保存。所取标本均经病理证实。按国际妇产科协会(Federal Institute of Gynecology and Obstetrics，FIGO) 2000年标准进行手术-病理分期，子宫内膜癌Ⅰ期20例，Ⅱ期9例，Ⅲ期6例， Ⅳ期2例。其中高分化有22例，中分化有13例，低分化有2例。患者年龄24 ～ 69岁，平均年龄49.4岁。患者术前均未行化疗、放疗、免疫、激素治疗等抗肿瘤治疗。

　　1.2 组织基因组DNA提取和DNA亚硫酸钠处理

　　组织基因组DNA提取试剂盒购自北京TIANGEN生物技术有限公司，按照试剂盒的说明提取标本的基因组。亚硫酸修饰DNA的方法[1]：1 μg DNA溶于50 μL的水中，加入NaOH(终末浓度为0.2 mol/L)， 37 ℃变性10 min，再加入10 mmol/L的氢醌30 μL(Sigma公司)和3 mol/L亚硫酸氢钠(Sigma公司，pH 5.0) 520 μL，混匀后加矿物油50 ℃孵育16 h。应用Wizard DNA纯化柱(Promega公司)纯化修饰DNA;纯化后的DNA再用NaOH(终末浓度为0.3 mol/L)于室温下处理5 min，乙醇沉淀，回收沉淀的DNA溶于30 μL的水中，-80 ℃储存备用。

　　1.3 甲基化和非甲基化聚合酶连反应

　　亚硫酸氢钠修饰的DNA进行巢式PCR，检测组织hMLH1基因是否甲基化。修饰的DNA经首轮PCR放大hMLH1基因的CpG岛，PCR引物为：5′-GGAGTGAAGGAGGTTAYGGGTAAGT-3′(forward)，5′-AAAAACRATAAAACCCTATACCTAA TC-3′(reverse)。PCR扩增片断为182 bp。

　　第一轮PCR产物经过50倍稀释后作为第二轮PCR反应的模板。其中甲基化聚合酶连反应(Methylation-Specific PCR， MSP)引物为：5′-ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC-3′(forward)，5′-CCTCATCGTAACTACCCGCG-3′(reverse)。非甲基化PCR(Un-Methylation-Specific PCR， UMP)引物为：为5′-TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT -3′(forward)，5′-ACCACCTCATCATAACTACCCCA-3′ (reverse)。

　　两轮PCR反应体系都为30 μL。第一轮PCR的条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸30 s循环40次，72 ℃再延伸5 min。第二轮PCR的退火温度为61 ℃，循环25次。PCR产物采用2%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并成像。第二轮PCR产物大小分别为115 bp (MSP)和124 bp (UMP)。

　　1.4 免疫组化

　　组织标本经福尔马林固定，石蜡包埋标本，制成4 μm的切片。将切片脱蜡，水化，浸入30 mL/L的H2O2溶液中，置于室温下10 min，封闭内源性过氧化酶。再置于pH 6.0的0.01 mol/L枸橼酸缓冲液中，微波炉加热修复抗原。将切片置于5 mL/L的牛血清白蛋白中孵育5 min，减少非特异性染色。滴加第一抗体：鼠抗人hMLH1蛋白单克隆抗体 (购自Zymed laboratories Inc)约20 μL，工作浓度1∶50， 4 ℃孵育过夜。PBS洗涤，滴加生物素标记的第二抗体，置于37 ℃孵育30 min，PBS洗涤，滴加过氧化物酶标记的链霉素抗生物素蛋白，置于37 ℃孵育30 min，PBS洗涤，DAB显色。蒸馏水冲洗，苏木素复染。中性树胶封片显微镜下观察。

　　hMLH1蛋白产物表达特征：正常细胞hMLH1阳性表达主要定位于细胞核，呈棕黄色，而且各种病变组织中hMLH1基因产物的表达特征基本相同。每例均随机观察5个视野( × 200)，参照文献报道的判定方法进行计数：阳性着色细胞数≥10%为阳性表达，阳性着色细胞数<10%为阴性表达。在高倍视野下拍照( × 400)。

　　1.5 统计学方法

　　试验结果采用SPSS 11.0统计软件对所得数据进行分析。两种不同的组织标本进行比较， 采用Chi-square检验或Fisher精确概率检验进行分析。检验水准α = 0.05，以P < 0.05认为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 两种组织hMLH1蛋白表达的比较

　　hMLH1蛋白在子宫内膜癌肿瘤组织的表达率为51.40%(19/37)，在正常的增生期内膜组织表达率为85.00%(17/20)。两者之间差异具有显著统计学意义(P < 0.05，图1)。

　　2.2 两种组织hMLH1基因甲基化率的比较

　　在子宫内膜癌肿瘤组织中，hMLH1基因的甲基化率为43.2%(16/37)，在正常的子宫内膜组织中的甲基化率为15.0%(3/20)。肿瘤组织中hMLH1的甲基化率明显高于正常的子宫内膜组织，两者之间差异具有显著统计学意义(P < 0.05，图2)。

　　2.3 两种组织中hMLH1的甲基化与蛋白表达的关系

　　子宫内膜癌组织中检测到的16例hMLH1甲基化阳性的组织有2例， hMLH1蛋白表达阳性(表达率12.5%)，未发生甲基化的21例中有17例表达hMLH1蛋白表达(表达率80.9%)，两者之间具有相关性(P < 0.05)。正常子宫内膜组织中检测到的3例发生甲基化的组织有1例蛋白表达(表达率为33.3%)，未发生甲基化的17例中有16例表达阳性(表达率94.1%)，两者之间具有相关性(P < 0.05)。

　　2.4 临床病理因素与hMLH1蛋白表达及DNA甲基化的关系

　　hMLH1蛋白表达与组织学分级(G1， G2， G3)有关(P < 0.05)，但与其它临床病理因素：肿瘤肌层浸润、淋巴结转移、FIGO分期和肿瘤宫颈浸润无相关性(P > 0.05)。hMLH1的甲基化与组织学分级、肿瘤肌层浸润、淋巴结转移、FIGO分期和肿瘤宫颈浸润均无相关性(P > 0.05，表1)。

　　3 讨 论

　　DNA错配修复(mismatch repair， MMR)是重要的突变避免系统，它通过校正正常DNA代谢中产生的碱基错配及调节DNA损伤所诱导的凋亡来维持基因组的稳定性[2]。它首先是在遗传性非息肉性结直肠癌综合征(hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome， HNPCC)中发现，HNPCC患者家族成员中常携带错配修复基因改变，该改变是子宫内膜癌最常见的分子缺陷机制[3]。错配修复基因hMLH1缺陷携带者患子宫内膜癌的风险为42%，甚至超过患结肠癌的风险(30%)[4]。

　　3.1 hMLH1甲基化或蛋白表达与子宫内膜癌的关系

　　本研究应用MSP和免疫组化方法研究子宫内膜癌组织和正常宫内膜组织hMLH1的甲基化状态与蛋白表达的关系。结果发现与正常宫内膜组织相比，子宫内膜癌组织hMLH1基因蛋白表达率减少，DNA甲基化率增加，其差异均具有统计学意义。提示hMLH1基因甲基化和蛋白表达缺失，参与了子宫内膜癌的发生发展。该研究与hMLH1基因甲基化在肝癌中的研究结果相同[5]。hMLH1蛋白表达减少，DNA复制过程的错误不能纠正，有助于导致子宫内膜癌的发生。

　　3.2 hMLH1甲基化与蛋白的关系

　　癌组织中18例hMLH1蛋白表达阴性，其中14例就存在hMLH1的DNA甲基化;正常组织中3例hMLH1蛋白表达阴性，其中2 例甲基化;提示hMLH1的甲基化导致蛋白表达缺失，此结果同其他研究结果。在本组病例中，4例癌组织中和1例正常组织，hMLH1蛋白表达缺失，但hMLH1的甲基化阴性，说明hMLH1蛋白表达缺失还有其它机制，包括点突变、缺失、插入、读码框架移位。在其它恶性肿瘤包括结肠癌、胃癌、大肠癌、乳腺癌和卵巢癌等，DNA甲基化也是hMLH1基因失活的常见方式[6-9]。本研究16例甲基化的癌组织中有2例蛋白表达阳性，同时3例甲基化的正常组织中1例蛋白表达阳性，此结果可能与肿瘤的异质性有关，或者仅仅在等位基因的一个基因发生了甲基化修饰。

　　3.3 hMLH1蛋白与临床参数的关系

　　本研究发现， hMLH1蛋白在子宫内膜癌不同病理分化程度中的表达差异有统计学意义，且hMLH1 表达阳性者均为中、高分化型(G1、G2);虽然hMLH1蛋白表达与子宫内膜癌的淋巴结转移、肌层浸润、手术分期、宫颈浸润之间无统计学相关性(P > 0.05)， 但是hMLH1 表达阳性率高者均为淋巴结无转移、宫颈无浸润、手术分期Ⅰ期，这些均是内膜癌预后良好的指标。有效的预后指标有助于临床医师采取最恰当的治疗措施。hMLH1 蛋白表达的测定有可能成为预测子宫内膜癌预后的指标。与林美芳等[10]研究结果相似，认为hMLH1的表达是的独立预后因素之一。

　　3.4 hMLH1甲基化与临床参数的关系

　　能否利用hMLH1启动子甲基化与子宫内膜癌临床病理特征的关系，来研究肿瘤的分类，早期发现和治疗以及预测其复发转移等问题，报道较少且观点不尽相同。Salvesen等[11]研究发现hMLH1启动子甲基化和病人年龄、FIGO分期、组织学分级、激素受体水平均无关。而Goodfellow[12]研究发现 hMLH1启动子甲基化与发病年龄和肿瘤组织学分类有关。Horowitz[13]研究发现hMLH1 启动子甲基化发生在子宫内膜癌的早期，而与肿瘤转移等恶性行为无确切的联系。而学者Black[14]等认为伴有hMLH1启动子甲基化的子宫内膜癌患者有较高的总体生存率和无病存活期。因此认为hMLH1基因甲基化可能参与了肿瘤发生的某些早期事件，其甲基化程度的高低可以作为评定预后的指标之一。本研究研究结果提示随着肿瘤组织分化程度的降低(从高分化到低分化)，浸润肌层的深度增加，hMLH1 甲基化率也随之增高，但统计学上差异无显著性，可能与病例数较少有关。

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