脂肪组织中ＩＲＳ-１相关的ＰＩ３Ｋ活性在多囊巢综合征胰岛素抵抗中的作用

　　作者：王竹晨， 邱洁， 赖伟英， 丘惠娜， 胡钶， 顾熊飞， 杨冬梓， 邝健全 作者单位：深圳市第二人民医院妇产科，广东 深圳 518035

　　【摘要】 【目的】 探讨多囊卵巢综合征(PCOS)脂肪组织胰岛素受体底物I相关的磷脂酰肌醇3激酶(IRS-1-Associcrted-PI3K)的活性在PCOS发病中的作用。【方法】 PCOS患者和对照者根据体质量指数(BMI)分为PCOS肥胖组、PCOS非肥胖组、 肥胖对照组和非肥胖对照组，各12例，采用免疫沉淀、薄层层析、放射自显影半定量检测脂肪组织IRS-1相关的PI3K活性。【结果】 脂肪组织中IRS-1- Associated PI3K 活性在PCOS肥胖组为55% ± 24%，较非肥胖对照组84% ± 16%明显降低(P < 0.001);肥胖对照组为46% ± 22%，PCOS非肥胖组为71% ± 26%，均较非肥胖对照组明显降低(P < 0.001和P < 0.05)， PCOS肥胖组和肥胖对照组之间以及PCOS肥胖组和PCOS非肥胖组之间的差异均无显著性意义(P > 0.05)。【结论】 PCOS肥胖组和PCOS非肥胖组脂肪组织IRS-1相关的PI3K活性均较非肥胖对照组明显减弱，可能抑制胰岛素受体后的信号传导，并与PCOS胰岛素抵抗的发生有关。

　　【关键词】 多囊卵巢综合征;胰岛素抵抗;脂肪组织;胰岛素受体底物I相关的PI3K活性

　　Insulin Receptor Substrate I-Associated Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K) Activity in Adipose Tissue of PCOS

　　WANG Zhu-chen， QIU Jie， LAI Wei-yin， QIU Hui-na， HU Ke， GU Xiong-fei， YANG Dong-zi， KUANG Jian-quan

　　(Department of Obstetrics and Gynecology， Shengzhen Second People′s Hospital， Shengzhen 518035， China;Department of Surgery， Shengzhen Baoan People′s Hospital， Shengzhen 518101， China;Department of Biochemistry， Zhongshan School of Medicine，SUN Yat-sen University， Guangzhou 510080， China; Department of Obstetrics and Gynecology， SUN Yat-sen Memorial Hospital， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510120， China)

　　Abstract： 【Objective】 To study insulin receptor substrate I-associated phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) activity of adipose tissue in polycystic ovary syndrome (PCOS) to approach the mechanism of insulin resistance (IR) in PCOS at the tissular and cellular level. 【Method】 Patients with PCOS and healthy controls were divided into the obese PCOS group， the non-obese PCOS group， the obese control group and the non-obese control group according to their body mass index (BMI) and with 25 cases each group. PI3K activity of adipose tissue were studied with immunoprecipitation， TLC， and phosphorimaging. 【Result】 PI3K activity of adipose tissue in the obese PCOS group (55% ± 24%， P < 0.001)， the obese control group (46% ± 22%， P < 0.001) and in the non obese PCOS group (71% ± 26%， P < 0.05) were markedly lower than the non obese control group(84% ± 16%). The difference both between the obese PCOS group and the obese control group and the two PCOS groups were not significant(P > 0.05). 【Conclusion】 PI3K activity of adipose tissue in the two PCOS groups both decrease markedly than the non obese control group. It might lead to the disorder of insulin-signaling transduction downstream of insulin receptor and concern with the IR.

　　Key word：polycystic ovary syndrome;adipose tissue;insulin resistance;insulin receptor substrate I-associated phosphatidylinositol 3-kinase

　　多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是以双侧卵巢呈多囊性改变伴不孕、多毛、痤疮，月经紊乱的一组症候群。临床特点是高雄激素血症和不排卵。其病因不明。目前认为PCOS是以胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)为特征的内分泌代谢疾患，继发于胰岛素抵抗的高胰岛素血症对造成高雄激素征象起着重要作用[1]。目前PCOS发生IR的机制尚不明了，为探讨PCOS IR的发病机制，我们对PCOS患者脂肪组织胰岛素受体底物I相关的磷脂酰肌醇3激酶(insulin receptor Substrate I-associated phosphatidylinositol 3-kinase，IRS-1-Associated PI3K)的活性进行了研究，现报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　收集我院和深圳宝安区人民医院妇科病房从2005年1月至2007年1月临床确诊为PCOS患者24例，临床症状及内分泌检查均符合PCOS诊断[1]，术后病理检查证实为多囊卵巢。24例PCOS患者据体质量指数[体质量/身高2(kg/m2)]分为肥胖组(体质量指数≥24 kg/m2)和非肥胖组(体质量指数< 24 kg/m2)各12例;另随机收集妇科病房诊为卵巢囊肿或输卵管阻塞行开腹手术的肥胖和非肥胖妇女各12例。上述各组均无其它急慢性疾病。术中开腹时切取皮下脂肪组织适量，迅速置液氮中冻存。

　　1.2 方法

　　1.2.1 脂肪组织蛋白质的提取 称取脂肪组织适量，即浸入冰冷细胞裂解液中(每克组织约需1 mL)，4 ℃组织匀浆，1 000 × g低温离心10 min，去除脂肪层后加入1.0 mg/mL PMSF贮存液(每克组织约需30 uL)，冰浴30 min，转入离心管内13 000 × g低温离心15 min，收集上清即为脂肪组织蛋白质抽提液。DNA/蛋白质分析仪测定蛋白质浓度，分装后置-20 ℃冰箱冻存[2]。

　　1.2.2 脂肪组织IRS-1相关的PI3K的活性 采用免疫沉淀、薄层层析和放射自显影法检测PI3K的活性。取各样本蛋白质1 mg，加入抗IRS-1多克隆抗体4 ug，4 ℃孵育过夜，加入40 uL蛋白 A-Sepharose 4 ℃孵育2 h，4 ℃ 9 000 × g离心1 min，含1% Nonidet P-40 的冰冷PBS Tris(pH7.4)洗涤3次;含500 mmol/L LiCl 的100 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)洗涤2次;溶液A[10 mmol/L Tris-HCl(pH7.4)，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA]洗涤1次;溶液B[20 nmol/L Tris(pH7.4)溶液含100 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L ethyleneglycol-bis-(?茁-aminoethyl ether)-N， N， N′，N′-tetraacetic acid， 120 umol/L adenosine]洗涤1次。

　　所得免疫沉淀物加入40 uL溶液B重悬后，与5 uL溶液C(2 ug/uL phosphatidylinositol 和phosphatidylserine， 20 nmol/L HEPES， 1 mmol/L EDTA，pH7.4)30 ℃孵育10 min。PI3K反应通过加入5 uL 280 umol ATP (含555 kBq [γ-32P]ATP)开始。30 ℃下不断摇动10 min后用200 uL浓度为1 mol/L的HCl终止反应。加160 uL氯仿与甲醇(1∶1)混合物，充分混匀以抽提 phosphatidylinositol 3- phosphate (PI3P)。13 000 × g 离心5 min，弃上层水相，将下层有机相移入另一EP管中待测。室温下冻干。加5 uL氯仿与甲醇(1∶1)混合物重溶解提取物，点样在薄层硅胶板上，在展层液中展层分离。对展层后的薄层硅胶板进行磷屏扫描测定32P的放射活性，结果用OptiQuant 3.0分析。

　　1.3 统计学处理

　　应用方差分析和q检验进行统计学处理。

　　2 结果

　　2.1 各组的临床资料

　　PCOS两组分别与其体质量相匹配的对照组相比， 年龄(t肥=1.70， P > 0.05;t非肥=1.62， P > 0.05)和BMI(t肥=1.64， P > 0.05;t非肥=1.58， P > 0.05)均无统计学差异。

　　2.2 各组脂肪组织IRS-1相关的PI3K活性磷屏扫描图像分析

　　PCOS两组和肥胖对照组脂肪组织IRS-1相关的PI3K活性均较非肥胖对照组明显降低(F =3.53，P < 0.05)，且以肥胖对照组降低更为明显， PCOS肥胖组和肥胖对照组之间以及PCOS两组之间的差异均无显著性意义(图1，表1)。

　　3 讨论

　　PCOS患者发生IR的机理尚不明了，可能与胰岛素受体后的信号传导障碍有关[3-5]，但机制不清，还需要进一步深入探讨。我们既往的研究提示PCOS脂肪组织IRS-1酪氨酸磷酸化作用较非肥胖对照组明显减弱，可能抑制INS受体后的信号传导，并与PCOS IR的发生有关[6，7]。

　　最早发现的含有SH2结构并能与IRS-1结合的蛋白质是PI3K[8]。PI3K由一个110 ku的催化亚单位和一个85 ku的调节亚单位(P85a)组成。P85a有两个SH2和一个SH3结构区。IRS-1上的YMXM基元磷酸化后与P85a的SH2结合，并活化PI3K。三维晶体结构分析显示，SH2与IRS-1的结合发生在某些特定区域，这种结合位置的特异性是由磷酸氨酸周围的氨基酸顺序决定的，即YMXM基元，并且P85a只能与已磷酸化的YMXM基元结合。IRS-1有4个能与P85a结合的位置，结合的先后顺序依次为：Y608MPM、Y939MNM、Y987MTM和Y460ICM。PI3K是调节细胞摄取葡萄糖的重要物质，PI3K活性降低后，脂肪细胞摄取葡萄糖量下降，葡萄糖转运体由胞浆到胞膜的转移减少。PI3K的活性与基础状态骨骼肌细胞浆和胞膜上的葡萄糖转运体数量密切相关。PI3K对胰岛素刺激的细胞摄取氨基酸过程也有一定的调节作用。PI3K的活性与IRS-1的磷酸化程度呈正相关。但当PI3K的活性达到一定程度时，进一步磷酸化IRS-1并不能增加PI3K的活性。我们此次的研究表明，PCOS两组和肥胖对照组脂肪组织IRS-1相关的PI3K活性均较非肥胖对照组明显降低，且以肥胖对照组降低更为明显，PCOS肥胖组和肥胖对照组之间以及PCOS两组之间的差异均无显著性意义。提示PCOS患者发生IR的机理可能与胰岛素受体后的信号传导障碍有关。

　　【参考文献】

　　Dunaif A. Insulin resistance in women with polycystic ovary syndrome[J]. Fertil Steril，2006，86(Suppl 1)：S13-14.

　　del Aguila LF， Claffey KP， Kirwan JP. TNF-alpha impairs insulin signaling and insulin stimulation of glucose uptake in C2C12 muscle cells [J]. Am J Physiol， 1999，276(5 Pt 1)：E849-855.

　　Corbould A， Kim YB， Youngren JF， et al. Insulin resistance in the skeletal muscle of women with PCOS involves intrinsic and acquired defects in insulin signaling[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab， 2005， 288(5)： E1047-1054.

　　Li M， Youngren JF， Dunaif A， et al. Decreased insulin receptor (IR) autophosphorylation in fibroblasts from patients with PCOS： effects of serine kinase inhibitors and IR activators[J]. J Clin Endocrinol Metab， 2002，87(9)：4088-4093.

　　Dunaif A， Wu X， Lee A， et al. Defects in insulin receptor signaling in vivo in the polycystic ovary syndrome (PCOS)[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab， 2001，281(2)：E392-399.

　　王竹晨， 顾熊飞， 杨冬梓， 等. 脂肪组织中胰岛素受体底物I的蛋白表达及其酪氨酸磷酸化在多囊卵巢综合征发病中的作用[J].中华妇产科杂志，2005，40(2)：120-123.

　　王竹晨， 顾熊飞， 杨冬梓， 等. TNFa对体外培养的人脂肪细胞葡萄糖摄取和IRS-1酪氨酸磷酸化的影响[J]. 中山大学学报：医学科学版，2005，26(1)：48-50.

　　Shepherd PR. Mechanisms regulating phosphoinositide 3-kinase signalling in insulin-sensitive tissues[J]. Acta Physiol Scand， 2005，183(1)：3-12.