Ｌｉｖｉｎ ｓｉＲＮＡ表达质粒的构建及其对宫颈癌ＨｅＬａ细胞的作用

　　作者：黄雪坤， 梁景耀， 李光仪 作者单位：( 佛山市第一人民医院妇产科，广东 佛山 528000，中山大学中山医学院药理教研室，广东 广州510080 )

　　【摘要】 【目的】 构建和鉴定针对人抑凋亡基因livin的siRNA质粒载体，并研究其对宫颈癌HeLa细胞的作用。【方法】 设计和合成针对人livin基因的siRNA寡核苷酸，定向克隆入质粒载体pmU6，脂质体瞬时转染入HeLa细胞中，用RT-PCR技术检测livin基因的mRNA表达水平，Western Blot技术检测Livin蛋白表达水平。用MTT法分析HeLa细胞增殖改变，流式细胞仪检测HeLa细胞周期变化。【结果】 livin siRNA表达质粒能高效而特异地剔除HeLa细胞中livin的表达，抑制肿瘤细胞增殖(P < 0.05)，将HeLa 细胞阻止在G1期。【结论】 livin基因的siRNA对HeLa细胞增殖和细胞周期调控有重要影响，细胞凋亡可能是导致其细胞死亡的主要原因。

　　【关键词】 livin; siRNA; 宫颈癌; 细胞凋亡

　　Construction of Livin siRNA Expression Plasmid and Its Effects on Cervical Cancer HeLa Cell

　　HUANG Xue-kun， LIANG Jing-yao， LI Guang-yi

　　( The First People′s Hospital of Foshan， Foshan 528000， China; Department of Pharmacology， Zhongshan School of Medicine， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510080，China )

　　Abstract： 【Objective】 To construct and identify an expression plasmid of siRNA targeting human inhibitor of apoptosis gene livin and to investigate its effects on cervical cancer HeLa cell. 【Methods】 The sequences targeting livin gene were designed and synthesized， then cloned into the eukaryotic expression vector pmU6 in definite direction. The livin siRNA plasmid was transiently transfected into HeLa cells via LipofectamineTM 2000. mRNA expression of livin gene was detected by RT-PCR， livin protein by Western Blot. The effects of the plasmid on HeLa cell proliferation were analyzed by MTT assay， on the cell cycle by flow cytometry. 【Results】 The livin siRNA plasmid knocked down livin expression in HeLa cells specifically and obviously，inhibited tumor cell proliferation (P < 0.05) and arrested the HeLa cells at G1 phase. 【Conclusion】 The livin siRNA in HeLa cell plays a crucial role in cell proliferation and cell cycle progression. Apoptosis might be the main way of the cell death.

　　Key word： livin; siRNA; cervical cancer; apoptosis

　　恶性肿瘤细胞往往因为抑凋亡基因高表达而出现永生化[1]。为此，如何敲除这些抑凋亡基因就成为基因治疗肿瘤研究的重要目标。Livin是近年来发现的人类凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins， IAP) 家族的新成员，在大多数正常成人组织不表达，而在多种肿瘤组织中常出现过表达， 能抑制凋亡刺激剂诱发的细胞凋亡，其抗细胞凋亡的作用甚至强于Survivin和Bcl?鄄2[2，3]。RNA干扰是近年来兴起的一项基因调控新技术，它属于转录后基因沉默机制，能特异而高效地沉默靶基因[4]。为此，我们应用RNA干扰技术，构建livin siRNA真核表达质粒，初步探讨该质粒对宫颈癌细胞HeLa的作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 设计和构建siRNA表达质粒

　　根据GenBank中报道的人livin基因(基因编号：AF311388)确定了siRNA序列，位置在转录启动子下游652 ～ 671 bp，按照Elbashir等[5]和Tuschl[6]的方法设计shRNA(short-hairpin RNA)。正义链5′-TTT GAG ACT TTG TCC ACA GTG TTT CAA GAG AAC ACT GTG GAC AAA GTC TCT TTT T-3′和反义链5′-CGA GAA AAA GAG ACT TTG TCC ACA GTG TTC TCT TGA AAC ACT GTG GAC AAA GTC T-3′，由上海生工生物工程服务有限公司合成。等量正义链与反义链模板退火，进而与BbsI 酶切的pmU6质粒(由广东医学院何承伟博士惠赠)连接，获得的重组质粒即为livin siRNA表达质粒，表示为pmU6 livin。

　　1.2 重组质粒的筛选

　　因插入片段太短，无法进行内切酶鉴定，故选取PCR 法鉴定。挑取8 个单菌落接种于5 mL 含200 μg/mL Amp 的LB 培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜。各取1mL 菌液于1.5 mL EP 管中，次日按QIAGEN 公司的试剂盒小量制备质粒DNA。进行PCR扩增，上游引物序列为5′-AGA GGT CAG GCA GCA TCG G-3′，下游引物序列为5′-CAA GAA ATC ATC CAC CAA ACG-3′，阳性重组克隆pmU6 livin扩增片段长为736 bp，空质粒pmU6扩增片段长为994 bp。PCR 扩增参数为94 ℃ 3min，94 ℃ 30 s， 46 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 共30个循环，72 ℃ 10 min。PCR扩增片段经2%普通琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.3 细胞培养和siRNA质粒转染

　　宫颈癌细胞HeLa为本室自存。人宫颈癌HeLa细胞均生长于含100 mL/L胎牛血清、20 g/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养液中，置37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱内孵育。细胞转染操作按LipofectmineTM 2000转染试剂盒(Invitrogen公司)说明书进行，在50 mm培养皿上转染10 μg质粒。对照组转染空载体pmU6，实验组转染pmU6 livin。pmU6 livin或pmU6质粒与表达绿色荧光蛋白的pEGFP-N1质粒以3∶1的比例共转染HeLa细胞，荧光显微镜下计数，确定其转染效率均超过85%。

　　1.4 RT-PCR分析

　　转染12、24、48和96 h后收集细胞，按TRIzol试剂盒(Invitrogen公司)说明书提取细胞的总RNA。RNA样品经逆转录反应合成livin cDNA，然后进行PCR扩增。RT-PCR扩增livin基因引物序列：上游引物5′-GTC ATC GCC AGC ATC ATC AA-3′，下游引物5′-CAA GAA ATC ATC CAC CAA ACG-3'，扩增片段长432 bp; 内参GAPDH引物序列：上游引物5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3′，下游引物5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′， 扩增片段长226 bp。扩增条件：25 μL反应体系中livin引物终浓度为0.6 μmol/L，GAPDH引物终浓度为0.06 μmol/L，dNTP各50 μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，Taq酶1 U。94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳(含0.05 g/L溴化乙啶)，拍照鉴定。

　　1.5 Western Blot分析

　　转染后12、24、48和96 h收细胞并裂解细胞，取50 ?滋g处理后的蛋白样品进行SDS-PAGE，电转移至NC膜，50 g/L脱脂奶粉封闭1 h，与1∶1 000稀释后的鼠抗人Livin单克隆一抗(Alexesis 公司)，或兔抗人β-Actin单克隆一抗(Santa Cruz公司)孵育过夜，TBST洗膜，然后与1：2 000稀释(用封闭液)后的抗小鼠或抗兔-辣根过氧化物酶标志的IgG二抗(北京中山生物公司)孵育1 h，TBST洗膜后，加入ECL试剂，曝光，显影，定影，对X光底片拍照，永久保存。

　　1.6 细胞增殖检测

　　采用MTT(Amresco公司)法，转染前按0.5×104细胞/孔种植在96孔板，转染0、12、24、48和96 h后，每孔加入10 μL 的5 g/L MTT，继续温育4 h，然后加入100 μL DMSO，震摇15 min，酶标仪读取光密度值A570按下列公式计算细胞增殖抑制率，抑制率-(1-AA/AB)×100，其中，B为对照组平均A值，A为实验组平均A值。

　　1.7 流式细胞术分析细胞周期

　　收集细胞，4 ℃条件下用70%冰冷乙醇固定过夜，离心，细胞重悬于PBS中30 min，再加RNase A室温下处理30 min，然后加碘化丙啶(PI;上海华舜公司)至20 mg/L，避光染色30 min以上，上样于EPTCSXL-31240流式细胞仪进行细胞周期的分析。

　　2 结果

　　2.1 重组质粒PCR筛选结果

　　重组质粒的琼脂糖凝胶电泳筛选结果显示(图1)，第1泳道为空质粒pmU6(对照组)， 第2～5，7～9泳道为插入针对人livin基因的siRNA寡核苷酸片段的阳性重组质粒pmU6 livin，第6泳道为没有成功插入针对livin基因的siRNA片段的空质粒pmU6。

　　2.2 RNA干扰抑制livin基因的mRNA表达

　　RT-PCR的琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，pmU6 livin干扰质粒转染Hela细胞48 h后，livin基因的mRNA表达已受到明显抑制(图2，泳道4)。而转染对照质粒pmU6，livin基因的mRNA表达明显高于转染干扰质粒 (图2，泳道1)。

　　2.3 RNA干扰抑制livin基因的蛋白表达

　　Western Blot结果显示，pmU6 livin干扰质粒转染HeLa细胞48 h后，内源性Livin蛋白的表达明显降低，而转染对照质粒pmU6中Livin蛋白的表达量明显高于转染干扰质粒组(图3)。

　　2.4 细胞增殖检测

　　MTT分析结果显示，用pmU6 livin质粒转染HeLa细胞0、12、24、48、96 h后，相对对照组，其细胞增殖抑制率分别为1.3%、9.5%(P < 0.05)、13.7%(P < 0.05)、18.7%(P < 0.05)、21.4%(P < 0.05)，而转染质粒pmU6的HeLa细胞增殖未见改变(图4)。

　　2.5 细胞周期检测

　　流式细胞仪分析结果显示，pmU6 livin质粒转染入HeLa细胞24 h后，与对照组比较，其G1期细胞比例显著降低，并出现凋亡峰，转染48 h后，实验组与对照组的凋亡峰比例进一步上升(图5)。

　　3 讨论

　　恶性肿瘤细胞凋亡失衡与肿瘤发生、发展和消退有着密切关系[1]。抑制IAPs 家族成员蛋白表达， 诱导肿瘤细胞发生凋亡， 是目前肿瘤靶向治疗的一个新的研究方向。Livin是人类凋亡抑制蛋白家族的新成员，具有杆状病毒IAP重复序列(baculoviral IAP repeats，BIR)，BIR结构域是其发挥抗凋亡作用的必需结构[3]。Livin 在大多数正常成人组织中不表达，特异性高表达于人的胚胎组织以及大多数人类实体瘤细胞中，如黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、白血病、非小细胞肺癌(NSCLC) 以及淋巴瘤等[7-10]。Livin通过抑制信号转导过程中的效应分子caspase-3/-7/-9的活性，抑制多种凋亡刺激剂诱发的细胞凋亡[9，11]。因此， 通过干预阻断Livin表达， 可能诱导肿瘤细胞的凋亡。

　　基因敲除能取得很好的效果， 但其方法太复杂，在临床应用上可行性不大。利用RNA干扰技术沉默特定基因，可实现快速、高效、个体化的基因治疗，且在需要的时候可以解除这种抑制，恢复基因的表达，就像使用药物一样，在疾病基因治疗上有广阔的应用前景[12]。siRNA 的制备方法之一为siRNA 表达载体法[13]：通过转染含有RNase 启动子U6 或H1 及其下游一小段特殊结构的质粒到宿主细胞体内，转录出shRNA(small hairpin RNAs)， shRNA 在胞内被RNAⅢ核酸内切酶剪切成siRNA，从而识别并降解同源基因的mRNA，最终达到抑制作用。在本实验中，我们针对livin基因的编码区设计了shRNA序列，并构建了可在真核细胞内表达RNAi序列的质粒，转染入细胞后在mRNA水平和蛋白水平成功特异性地沉默livin基因表达，从而引起宫颈癌细胞系HeLa发生细胞增殖抑制，这为以livin基因为靶点的肿瘤基因治疗提供实验依据和新思路。

　　【参考文献】

　　[1]张敏燕，张正民，韩仲明. 凋亡调控基因Bcl-2、Bax与肿瘤[J]. 国外医学：耳鼻咽喉科学分册，2004，28(1)：40-43.

　　[2]Gazzaniga P， Gradilone A， Giuliani L， et al. Expression and prognostic significance of livin， survivin and other apoptosis-related genes in the progression of superficial bladder cancer[J]. Ann Oncol，2003，14(1)：85-90.

　　[3]Liu B， Han M， Wen JK， et al. Livin/ML-IAP as a new target for cancer treatment[J]. Cancer Lett，2007，250(2)：168-176.

　　[4]夏忠胜，朱兆华，张立勇，等. MDR1 siRNA对结肠癌细胞多药耐药性的影响[J]. 中山大学学报：医学科学版，2007，28(3)：268-273.

　　[5]Elbashir SM， Martinez J， Patkaniowska A， et al. Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate [J].EMBO J，2001，20(23)：6877-6888.

　　[6]Tuschl T. Expanding small RNA interference[J]. Nat Biotechnol，2002， 20(5)：446-448.

　　[7]Chang H， Schimmer AD. Livin/melanoma inhibitor of apoptosis protein as a potential therapeutic target for the treatment of malignancy[J]. Mol Cancer Ther，2007，6(1)：24-30.

　　[8]Zhu Z， Wang Y， Ding X， et al. Expression and prognostic significance of livin in the progression of bladder cancer[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci， 2008，28(1)：90-92.

　　[9]Grzybowska-Izydorczyk O， Smolewski P. The role of the inhibitor of apoptosis protein (IAP) family in hematological malignancies[J].Postepy Hig Med Dosw，2008，62：55-63.

　　[10]Kasof GM， Gomes BC. Livin， a novel inhibitor of apoptosis protein family member[J]. J Biol Chem，2001，276(5)：3238-3246.

　　[11]Wang H， Tan SS， Wang XY， et al. Silencing livin gene by siRNA leads to apoptosis induction， cell cycle arrest， and proliferation inhibition in malignant melanoma LiBr cells[J]. Acta Pharmacol Sin，2007，28(12)：1968-1974.

　　[12]Kim D， Rossi J. RNAi mechanisms and applications[J]. Biotechniques， 2008，44(5)：613-616.

　　[13]郭海霞， 薛红漫， 夏 焱， 等. siRNA 对VEGFR2 的表达抑制及对HL60细胞和人内皮细胞的影响[J]. 中山大学学报：医学科学版，2006，27(3)：276-280.