早期行为疗法降低仔鼠脑损伤致脑性瘫痪的实验研究

作者：庞伟， 李晓捷， 张士岭    作者单位：154003 黑龙江 佳木斯，佳木斯大学附属第三医院小儿神经科(庞伟),小儿脑瘫科(李晓捷);佳木斯大学儿童神经康复实验室(庞伟,李晓捷,张士岭) 　　【摘要】  目的 研究早期行为疗法对降低仔鼠脑损伤所致脑性瘫痪(简称脑瘫)的影响。方法 取孕18 d大鼠21只连续2 d腹腔注射脂多糖，剂量为450 μg/kg，6只孕鼠腹腔注射同剂量的生理盐水。随机选取脂多糖组仔鼠分为干预组(n=20)和非干预组(n=30)，另设生理盐水组(n=30);生后2 d起，给予干预组仔鼠早期丰富环境刺激等行为疗法，另两组常规饲养;于生后25 d对3组仔鼠进行随意运动、姿势、肌张力、不自主运动、情感行为能力、倾斜板试验等检测，记录各项评分并进行统计学分析;取生后1 d的非干预组、生理盐水组仔鼠各10只、生后25 d的3组仔鼠各10只进行脑组织髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)、S100蛋白阳性细胞检测。结果 免疫组织化学显示：生后1 d的非干预组仔鼠脑组织各部位(内囊、海马、胼胝体)的MBP阳性染色较生理盐水组仔鼠均明显减少、减弱(P<0.01);生后25 d的干预组仔鼠脑组织各部位(内囊、海马、胼胝体)的MBP阳性染色较非干预组仔鼠均增多(P<0.05),生理盐水组仔鼠脑组织各部位(内囊、海马、胼胝体)的MBP阳性染色较干预组、非干预组仔鼠明显增多(P<0.01);生后1，25 d的非干预组仔鼠脑组织各部位(内囊、海马、胼胝体)的S100蛋白阳性染色与生理盐水组仔鼠相比较，均明显增加、增强(P<0.01)，干预组介于两者之间，差异有统计学意义(P<0.01)。神经行为学检测显示：干预组20只仔鼠中有4只鉴定为脑瘫鼠，非干预组有8只脑瘫鼠，而生理盐水组无脑瘫鼠。结论 MBP、S100蛋白可以作为脑损伤早期诊断及判断预后的指标;早期干预可降低宫内感染所致新生鼠脑瘫的发生。

　　【关键词】  脑性瘫痪; 脑损伤; 行为疗法; 大鼠; 动物，实验

　　Experimental study of the early behavior therapy to reduce cerebral palsy of the young rats due to brain damage PANG Wei，LI Xiaojie，ZHANG Shiling.Department of Pediatric Neurology，the Third Affliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154003,China

　　【Abstract】 Objective To study the effect of early behavior therapy to reduce cerebral palsy caused by brain damage in rats.Methods Totally 27 pregnant rats were consecutively injected with LPS(450 μg/kg，n=21) or saline(n=6) on gestation 18 d and 19 d.We selected randomly saline neonatal rat group B(n=30) and LPS neonatal rat group A1(n=20)，A2(n=30).The 2 d rats(A1) were given early behavior therapy，such as enriched environment and the rats(A2 and B) were routinely fed.The neurobehavior of the rats was observed in A1，A2 and B groups on 25 d.The MBP and S100 were detected in brain sections on 1 d and 25 d.Results MBP expression was obviously decreased in A2(1 d),compared with B of 1 d rats(P<0.01);MBP was increased in A1 of 25 d,compared with A2 of 25 d(P<0.05);it was increased in B,contrasted with A1 and A2(P<0.01).Compared with B,there was significant increase in A2 of 1 d with regard to S100(P<0.01).The result of S100 between A2 and B of 25 d was the same with 1 d rats,but the S100 of A1 was the middle of them(P<0.01).The result of neurobehavioral observation indicated that there were 4 cerebral palsy rats in A1,8 cerebral palsy rats in A2 and no cerebral palsy rat in B.Conclusion MBP and S100 can become the sign of early diagnosis and the therapeutic effect in brain injury.Early interference can reduce cerebral palsy.

　　【Key words】 Cerebral palsy; Brain damage; Behavior therapy; Rat; Animal，experiment

　　脑性瘫痪(简称脑瘫)指从出生前至出生后脑发育阶段，各种原因所致的非进行性脑损伤综合征，是造成小儿肢体残疾的主要疾病。可伴有智力低下、惊厥、行为异常、感知觉障碍及其他异常[1]。近年来流行病学研究表明,宫内感染是新生儿脑白质损伤的主要原因。因此对宫内感染导致新生儿脑白质损伤机制的研究日益得到重视。对宫内感染引起的脑损伤患儿进行早期诊断、早期干预，可提高脑损伤患儿的生活质量，降低脑瘫的发生，也是减少儿童残疾的重要课题。本研究采用早期丰富环境刺激等方法对脑损伤新生鼠进行早期干预，深入分析和探讨早期干预在脑瘫发生、脑损伤程度及脑瘫康复中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与试剂 成熟Wistar大鼠60只，雌性40只，雄性20只，体质量180～240 g，由佳木斯大学实验动物中心提供。脂多糖(脂多糖血清型055：B5，美国SIGMA公司)。脑组织髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)、S100蛋白免疫组织化学试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

　　1.2 动物模型制备与分组 将实验对象在室温(21±1)℃的环境下常规饲养2周后，于17时以2∶1合笼，次日上午8时查阴道涂片，以查得精子为妊娠0 d，孕鼠另笼饲养。使用随机数字法将动物分为生理盐水组(n=6)和脂多糖组(n=21)。给孕第18天的脂多糖组孕鼠脂多糖450 μg/(kg·d)，连续2 d腹腔注射，生理盐水组腹腔注射同剂量的生理盐水。孕22 d前分娩的仔鼠为早产鼠。两组均去除早产鼠。使用随机数字表法选取生理盐水组仔鼠(n=30)、脂多糖组仔鼠干预组(n=20)和非干预组(n=30)。

　　1.3 行为疗法干预措施

　　1.3.1 早期触摸 将生后2 d的干预组仔鼠托至掌心，用毛刷从头至尾匀速有力刷动，持续15 min，每日1次，干预7 d。

　　1.3.2 早期丰富环境 早期触摸结束后，于第8天给予干预组丰富环境刺激，每日暴露于丰富环境中2 h，干预至第24天。将60 cm×45 cm×45 cm笼内放置不同颜色及形状的物体，包括转盘、管道、台阶、摇铃、水面等，每周将环境改变2次，以造成新异刺激。

　　1.4 脑组织中MBP、S100阳性细胞测定 取生后1 d的非干预组和生理盐水组仔鼠各10只，生后25 d的干预组、非干预组和生理盐水组仔鼠各10只，麻醉后处死，取脑组织对MBP、S100蛋白进行免疫组织化学测定，统计阳性细胞表达情况。

　　1.5 神经行为学检测 对干预组、非干预组和生理盐水组仔鼠于生后25 d进行神经行为学检测，按下述内容检查及评分。鉴定为脑瘫的大鼠，必须同时具备神经行为学检查中随意运动障碍、姿势异常、肌张力异常;伴有或不伴有不自主运动、情感行为能力异常;倾斜板试验必须有一项是阳性。

　　1.5.1 随意运动障碍 (1)悬吊试验：使大鼠前腿抓住距离桌面45 cm的水平玻璃棒(直径0.5 cm)，记录大鼠掉下的时间，并进行评分。评分标准：1分：<10 s;2分：10～30 s;3分：31～119 s;4分：2～5 min;5分：>5 min。(2)斜坡试验：将大鼠头向下倒置于45°斜面上，记录大鼠转为头向上大于135°的时间，以秒为计算单位，进行两组比较。异常判定标准：具备下列任何一项为异常：悬吊试验分值低于对照组均数-1.96倍标准差;斜坡试验秒数高于对照组均数+1.96倍标准差。

　　1.5.2 姿势异常 包括：(1)主要以三肢支持身体;(2)主要以双肢支持身体;(3)不能站立。异常判定标准：具备上述任何一项表现为异常。评分标准：正常者满分为10分;出现上述改变(1)扣除2分;(2)扣除3分;(3)扣除5分。

　　1.5.3 肌张力异常 (1)肌张力增强：静止时，触诊四肢肌肉坚韧性增高;四肢与躯干之间关节被动活动受限;主动活动运动受限;(2)肌张力减低：静止时，触诊四肢肌肉坚韧性降低;四肢与躯干之间被动活动时关节活动过度，主动活动时肢体无力，关节伸展过度;(3)游走性增强或减低：肌张力变化。异常判定标准：具备上述任何一项表现为异常。评分标准：正常者满分为10分;出现上述改变(1)扣除4分;(2)扣除4分;(3)扣除2分。

　　1.5.4 不自主动作 包括：(1)震颤;(2)舞动;(3)抽搐;(4)徐动;(5)痉挛扭动。异常判定标准：具备上述任何一项表现为异常。评分标准：正常者满分为10分;出现上述任何一项表现扣2分。

　　1.5.5 情感行为能力测试 (1)旷场试验：装置为36 cm×36 cm×36 cm无顶方盒，箱底用墨线分成9个等分小格，将大鼠置于中央小方格内，观察30 s内活动情况。计分标准：大鼠1/2以上身体从所在方格进入相邻方格记1分;大鼠后肢性站立计1分;二者相加为其总分。(2)拒俘反应试验：以动物从未接触过的手套轻抓大鼠，观察其反应。计分标准：0分：很容易抓取动物;1分：尖叫或回避;2分：尖叫并回避;3分：逃脱;4分：逃脱并尖叫;5分：咬或试图撕咬手套;6分：主动跃起攻击。异常判定标准：具备上述任何一项，分值低于对照组均数-1.96倍标准差为异常。

　　1.5.6 倾斜板试验 (1)把大鼠放在倾斜15°的平板上，每秒抬高10°，至60°以上不下滑者(停留超过1 min)为阴性;(2)把大鼠放在倾斜75°的平板上，不下滑者(停留超过1 min)为阴性。阳性为异常。

　　1.6 统计学方法 实验数据以±s表示。采用SPSS 11.5统计软件进行统计。两样本均数两两比较采用t检验，方差不齐者采用t'检验。

　　2 结果

　　2.1 生后1，25 d各组仔鼠脑组织各部位(海马、内囊、胼胝体)的MBP和S100蛋白阳性染色结果 分别见表1，2。表1 生后1 d的非干预组、生理盐水组仔鼠脑组织MBP和S100蛋白阳性细胞检测比较注:与生理盐水组比较，aP<0.05，bP<0.01。表2 生后25 d的干预组、非干预组和生理盐水组仔鼠脑组织MBP和S100蛋白阳性细胞检测比较注:与干预组比较，aP<0.05，bP<0.01;与生理盐水组比较，cP<0.01。

　　表1结果表明，生后1 d的非干预组仔鼠脑组织各部位MBP均低于生理盐水组，S100蛋白阳性细胞数均高于生理盐水组，差异均有统计学意义(P<0.05，0.01)。

　　表2结果表明，生后25 d的干预组、非干预组仔鼠脑组织各部位MBP均低于生理盐水组，S100蛋白阳性细胞数均高于生理盐水组，差异均有统计学意义(P<0.01)。干预组仔鼠脑组织各部位MBP均高于非干预组，S100蛋白阳性细胞数均低于非干预组，差异均有统计学意义(P<0.05，0.01)。

　　2.2 神经行为学检测结果

　　2.2.1 干预组、非干预组和生理盐水组仔鼠随意运动结果 见表3。表3 干预组、非干预组和生理盐水组仔鼠随意运动比较注：与生理盐水组比较，aP<0.01;与非干预组比较，bP<0.01。

　　悬吊试验可见非干预组仔鼠反应迟钝，稳定性差，悬吊时肢体自主活动明显减少，与干预组相比，悬吊时间明显减少,差异有统计学意义(P<0.01);生理盐水组仔鼠反应灵活，动作敏捷，在玻璃棒上可自由活动，甚至翻至玻璃棒上沿玻璃棒爬行，悬吊时间明显长于干预组和非干预组，差异有统计学意义(P<0.01)。

　　斜坡试验可见非干预组仔鼠运动速度慢，反应迟钝，在斜坡上停留时间较干预组长，差异有统计学意义(P<0.01);生理盐水组仔鼠反应敏捷，与干预组和非干预组相比差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.2.2 干预组、非干预组和生理盐水组仔鼠姿势、肌张力、不自主运动和旷场试验结果 见表4。表4 干预组、非干预组和生理盐水组仔鼠姿势、肌张力、不自主运动和旷场试验检测评分比较注：与生理盐水组比较，aP<0.05;与非干预组比较，bP<0.05。

　　表4结果表明，干预组、非干预组仔鼠的姿势和肌张力评分及非干预组仔鼠的旷场试验评分均低于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05);干预组仔鼠的旷场试验评分高于非干预组，差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2.3 倾斜板试验结果 干预组有4只异常，其中1只2项均为阳性，另外3只1项阳性;非干预组仔鼠有8只异常，其中3只2项均为阳性，另外5只1项阳性;生理盐水组均为阴性。

　　2.2.4 干预组、非干预组和生理盐水组仔鼠神经行为检测异常结果 见表5。干预组中有4只鉴定为脑瘫鼠;非干预组中有8只鉴定为脑瘫鼠;生理盐水组无脑瘫鼠。表5 干预组、非干预组和生理盐水组仔鼠神经行为检测异常结果

　　3 讨论

　　MBP是构成髓鞘的主要蛋白质，约占髓鞘蛋白总量的1/3。在中枢神经系统由少突胶质细胞合成。MBP位于髓鞘浆膜面，与髓鞘脂质结合，维持了中枢神经系统髓鞘结构和功能的稳定，而且在髓鞘形成过程中具有启动作用[2]。宫内感染可阻碍新生鼠髓鞘形成，或使髓鞘形成延迟，分析可能的原因为：细胞因子(肿瘤坏死因子、白细胞介素等)在宫内感染所致脑损伤中起重要作用，导致脑损伤的细胞因子来源于两部分，一部分是脂多糖诱导孕鼠子宫和胎盘产生的大量细胞因子，另一部分是由受孕鼠细胞因子刺激的胎鼠脑内小胶质细胞和星形胶质细胞产生的细胞因子[3]。两部分细胞因子共同作用，使成熟少突胶质细胞数量减少和(或)功能受损，导致MBP合成减少，髓鞘形成受阻。

　　S100蛋白是一种酸性钙结合蛋白，在中枢神经系统的星形胶质细胞、小胶质细胞、大胶质细胞、少突胶质细胞以及前部垂体细胞、郎罕细胞中存在，脑干大部分感觉神经和小脑的小脑核也有明显的分布。S100蛋白是脑损伤的重要标志蛋白，宫内感染可致神经胶质反应性增生，S100蛋白合成增加。其原因可能为：在中枢神经系统中S100蛋白主要由神经胶质细胞合成，宫内感染可致细胞因子(肿瘤坏死因子、白细胞介素等)合成和释放增加[4]，来自孕鼠子宫和胎盘的细胞因子可刺激胎鼠小胶质细胞和星形胶质细胞产生大量细胞因子[5]，两部分细胞因子共同作用，致使神经胶质细胞增生。细胞因子有促神经胶质细胞增生的作用，并且活体情况下细胞因子与小胶质细胞或少突胶质细胞合成分泌的一些营养因子，如血小板源性生长因子、表皮细胞生长因子、胶质源性神经营养因子等协同作用，促使增生作用进一步加强[6]。神经胶质细胞维持中枢神经系统的稳定，中枢神经系统遭受损伤时，神经胶质反应性增生，重建这种自身稳定。在小胶质细胞和星形胶质细胞增大、增生的同时伴有S100蛋白的浓度改变。S100蛋白水平升高与神经胶质细胞破坏和(或)胶质细胞大量增生填充神经元坏死留下的空缺有关。

　　早期干预是通过有组织、有目的的丰富环境(视觉、触觉、嗅觉、味觉、听觉等各方面丰富的环境刺激)来减少发育期脑损伤及神经系统后遗症，促进脑损伤康复的一种手段。生后早期暴露于丰富环境，给予多感觉刺激可使运动皮质和视觉皮质树突长度增加及分枝增多，并使脑组织代谢增强、脑血流变化及结构发生改变[7]。研究证实：通过早期干预可以显著改善缺氧缺血性脑损伤预后，降低伤残发生率[8]。早期触摸和丰富环境刺激是对发育期脑损伤进行早期干预最常用且行之有效的方法[9]。皮肤是身体上感受器分布最广泛部位，通过触摸皮肤可以兴奋中枢感受器，刺激神经细胞的形成及其与触觉间的联系，逐渐促进神经系统发育和智能形成，代偿受伤的脑功能。此外抚触刺激还可以引起迷走神经张力增强，造成胃肠道内分泌活力增高，促进体格发育。早期触摸对脑损伤大鼠中枢神经系统的影响是使肌内的感受器(肌梭等)受到刺激而产生神经冲动，经脊神经后根进入脊髓，兴奋α运动神经元，使骨骼肌在α运动神经元的控制下运动协调化，建立正常的相反神经抑制机制。早期干预能够使中枢神经系统的协调、整合、控制能力增强[10]，尤其是肌力增加明显，而肌力增加又促通了平衡能力和协调能力的改善，同时不同的环境刺激提高了大鼠的兴奋性和对环境的适应能力。由于MBP在髓鞘形成过程中具有启动作用[11]，通过早期干预来调控MBP启动子的转录表达，促进MBP和髓鞘脂质结合，从而抑制了某些细胞因子(肿瘤坏死因子、白细胞介素等)对少突胶质细胞的进一步破坏，使MBP合成增多，加速髓鞘形成。早期干预使大鼠皮质厚度与重量增加，树突枝增多和突触增加，使受损脑通过轴突绕道投射，树突出现不寻常的分叉，并产生非常规的神经突触等途径进行功能代偿，从而抑制了神经胶质细胞大量增生，降低了S100的升高;环境刺激影响体内神经内分泌功能，早期干预可降低体内糖皮质激素水平[12]，从而减少其对海马的损伤，神经胶质细胞破坏减少，S100水平降低。

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