顺铂对人脐静脉内皮细胞ICAM1表达的影响

　　作者：段迎春, 黄光荣, 胡 平, 任 青 , 范 丽 作者单位：郧阳医学院附属人民医院妇产科，湖北 十堰 442000

　　【摘要】 目的:为细胞间黏附分子(ICAMs)是否参与顺铂引起的血管损伤病理反应寻找证据。方法: 将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)以不同浓度顺铂(Cisplatin)或同一浓度顺铂处理不同时间后，蛋白印迹分析法和RTPCR检测内皮细胞CAMs的表达情况，并通过凝胶阻滞分析(EMSA)和特异性抑制剂来探讨NFκB在其中的作用。结果: 顺铂能够在mRNA和蛋白水平明显上调内皮细胞中细胞间黏附分子1( ICAM1)的表达，而对P选择素、E选择素和VCAM1的表达无明显影响。其表达是通过核因子κB ( NFκB)依赖途径实现。结论: ICAM1参与了顺铂的血管毒性病理过程，具有靶向治疗前景。

　　【关键词】 顺铂;细胞间黏附分子;内皮细胞;核因子κB

　　Effect of Cisplatin on ICAM1 Expression in Human Umbilical Vein Endothelial Cells DUAN Yingchun,HUANG Guangrong*,HU Ping,REN Qing,FAN Li (Department of Obstetrics and Gynecology,Renmin Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract: Objective To explore whether CAMs are involved in the pathogenesis of vascular injury induced with cisplatin.Methods Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were treated with different concentrations of cisplatin or for different time for cisplatin respectively,the expression of ICAMs in endothelial cells were analyzed by RTPCR and Western blot,and the role of NFκB in the CAMs expression was investigated by EMSA and specific inhibitor.Results Cisplatin could upregulate the expression of ICAM1 at both mRNA and protein levels,but had no significant effect on the expression of Pselectin,Eselectin,and VCAM1,and the expression was through a NFκBdependent pathway.Conclusion ICAM1 involves in the pathogenesis of cisplatininduced vascular toxicity and is valuable for clinical targeting therapy.

　　Key words:Cisplatin;ICAM;Endothelial cell;NFkappa B

　　大多数肿瘤的治疗有赖于联合治疗方案，其中顺铂是广泛用于成人和儿童恶性肿瘤的最有效的化疗药物之一，它主要通过与DNA相互作用，形成DNA加和物，启动细胞凋亡而发挥抗癌效应[1];但同时也对人体产生严重的毒副作用，如与抗血管生成药物联合应用后，会出现程度不一的剂量依赖式累积肾毒性[2]、耳毒性[3]、神经毒性[4-5]以及血栓形成[6]。前期研究提示顺铂诱导的耳、肾、周围神经和自主神经系统的毒性与微血管损害有关。顺铂存在情况下，耳的血管纹微血管[7]、肾脏的肾小球毛细血管[8]、神经系统的神经滋养血管[9]受到不同程度的损害。动物实验和临床报道也显示血管因素参与了顺铂引起的肾功能不全。但迄今为止，这些毒副作用的机制尚未明了。

　　细胞间黏附分子(cell adhesion molecules,CAMs)属于跨膜糖蛋白，参与白细胞向内皮或细胞外基质的黏附，在如胚胎形成、免疫反应和炎症等诸多病理生理过程中具有重要作用。顺铂暴露的情况下，动物肾脏组织[10]或人类肿瘤细胞系[11]中CAMs表达上调，而其在内皮细胞中的表达情况未见系统研究，因而本研究旨在探讨CAMs在顺铂诱导的血管损伤中的潜在作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 细胞培养

　　人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的分离和培养方法参照常规方法。置于含5%CO2的细胞培养箱中37℃孵育，为避免遗传突变和活力减低，实验所用细胞均为6代以内。同一批细胞暴露于不同浓度的顺铂，或以同一浓度顺铂处理不同时间后，收集细胞，常规方法提取蛋白和RNA供后续分析。

　　1.2 蛋白印迹分析

　　全细胞蛋白裂解液经BCA法进行蛋白定量后，以20 μg/孔的上样量进行12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分离细胞间黏附分子1(Intercellular adhesion molecule 1,ICAM1)，P选择素(Pselectin)，E选择素(Eselectin)和血管黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1)以及IκBα。转PVDF膜后，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，PBST洗膜3次，10 min/次，然后用相应一抗杂交(1∶500，PBST稀释)4℃摇床过夜，PBST洗膜后，加入相应过氧化物酶标记二抗(1∶10 000，PBST稀释)室温1 h，再次洗膜后，加入ECL，在Genegnome Bio Imaging System for Chemiluminescence 上曝光显影，并以Gene tools软件进行定量分析。回收PVDF膜后，以strip buffer漂洗后，进行内参βactin检测。每组实验至少重复3次。

　　1.3 RTPCR

　　利用Trizol试剂从顺铂处理的内皮细胞中提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定A260/A280，计算RNA浓度，取2 μg总RNA按Access RTPCR System(Promega公司)试剂盒说明进行RTPCR操作。实验中各CAMs的特异性引物序列见表1。

　　1.4 凝胶阻滞分析(EMSA)

　　应用核蛋白提取试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)提取内皮细胞核蛋白。以Pierce公司的LightShift Chemiluminescent EMSA Kit检测核蛋白-DNA间的相互作用。NFκB共有核甘酸探针的正义链为5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'，反义链为3'-TCAACTCCCCTGAAAG GGTCCG-5'，由英骏公司合成，并对5'端进行生物素标记。具体实验步骤参照试剂盒说明进行。

　　1.5 统计学分析

　　实验数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用SPSS 10.0软件的OneWay ANOVA进行统计，检验水准为α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 顺铂对人脐静脉内皮细胞ICAM1表达的影响

　　白细胞与内皮之间的相互作用是由黏附分子介导的，为弄清内皮细胞经顺铂处理后，能否上调黏附分子的表达，从而促进白细胞内皮之间的相互作用，介导顺铂引起的毒副作用，尤其是微血管损害。我们将人脐静脉内皮细胞以各种不同浓度的顺铂处理，或以同一浓度处理不同时间后发现，不同剂量 (1, 2, 4, 6, 8 and 10 μg/mL)顺铂处理内皮细胞24 h后均能明显提高ICAM1的蛋白表达水平，以6 μg/mL剂量组为著;4 μg/mL顺铂对内皮细胞进行不同时段的处理后发现，ICAM1的蛋白表达水平在4 h就开始增加，24 h达到峰值(图1A)。

　　为进一步揭示顺铂在转录水平上对介导白细胞-内皮相互作用的黏附分子的影响，应用RTPCR对各黏附分子的mRNA水平进行了检测。结果发现，4 μg/mL顺铂能够在作用4 h后显著增加内皮细胞ICAM1的mRNA表达，24 h后达到峰值;而不同浓度的顺铂处理内皮细胞24 h后,8 μg/mL顺铂处理组ICAM1的mRNA增加水平最高(图1B)。但其它受试的黏附分子如VCAM1,Eselectin 和 Pselectin在蛋白和mRNA水平上均未见明显改变。

　　2.2 顺铂能够活化内皮细胞NFκB信号

　　进一步研究顺铂处理后内皮细胞ICAM1的表达上调是否通过NFκB信号途径实现，结果显示，6 μg/mL顺铂处理后的内皮细胞IκBα蛋白含量迅速降低(图2A)，同时，NFκB p65蛋白的核转位迅速增加(图2B)。

　　如图2C所示，凝胶阻滞分析(EMSA) 发现，顺铂处理1 h后，NFκB与其反应元件的结合能力显著增强(第2泳道)，并能够持续到3 h(第6泳道)。这种结合力的增加能够被5 μmol/L的NFκB特异性抑制剂SN 50阻断(第4、8泳道),且200倍浓度的过量未标记探针能够同标记的探针竞争性结合NFκB(第3、5、7、9泳道)。

　　为进一步确认顺铂所诱导的ICAM1在内皮细胞中的表达的确是通过NFκB复合物核转位引起，本研究以SN 50(它含有核定位序列，能够阻断后者的胞内识别器，从而阻止NFκB/Rel复合物核转位)先于顺铂30 min处理内皮细胞，来观察ICAM1的表达情况。如图3所示，5 μmol/L的NFκB特异性抑制剂SN 50几乎能够完全抑制顺铂所引起的ICAM1在蛋白和mRNA水平上的表达增加，而SN 50本身对ICAM1的表达无显著影响。

　　3 讨论

　　顺铂的临床应用是肿瘤化疗学上的一项重大进展，它除了通过抗增殖和细胞毒性机制发挥直接抗肿瘤效应外，还可能通过抑制肿瘤生长所需的血管新生来发挥间接的抗肿瘤效应。虽然顺铂是迄今研制的最重要的抗癌药物之一，但其毒副作用仍然限制着它的潜在效能。直到最近，人们仍在深入研究减少和/或减轻顺铂相关毒性的方法和手段[3,4,9,10]。顺铂所致的肾毒性、耳毒性、神经毒性与其所致的微血管损害[7-9]有关，其机制可能与顺铂在体内和体外对内皮细胞均有增殖抑制作用有关[9]。但越来越多的组织病理学证据表明，顺铂能够加剧内皮细胞功能不全和白细胞浸润[10,12]，预示顺铂可能能够促进黏附分子介导的白细胞/内皮相互作用，后者参与了顺铂诱导的病理生理过程。因而对黏附分子的表达情况进行检测将有助于加深对顺铂毒性的起始、进展、临床表现及防治的理解。

　　NFκB是一个参与调控炎症、免疫和应激反应等生物过程相关基因的转录因子。在大多数细胞中，NFκB与其抑制蛋白(IκBs)结合在一起储留在胞浆中呈非活化状态。当刺激因素存在时，IκBα被IκB激酶(IKK)复合物磷酸化而降解，NFκB被释放而自由转位到细胞核，从而调节靶基因的表达。顺铂能够诱导肾组织表达ICAM1，且NFκB是ICAM1启动子上最重要的诱导型转录因子。

　　本研究发现，顺铂处理内皮细胞后，能够呈时间和剂量依赖式上调ICAM1在蛋白和mRNA水平上的表达，而其它在白细胞-内皮相互作用中也发挥重要作用的黏附分子[13]，如VCAM1,Eselectin和Pselectin的表达水平则无明显改变。为深入探究这种现象的潜在分子机制，我们推测顺铂诱导的ICAM1表达上调是通过NFκB的活化来介导的，因为后者是ICAM1启动子区最重要的诱导型转录因子。结果印证了假设，人工合成的NFκB特异性抑制剂SN 50几乎能够完全阻断顺铂所引起的ICAM1在蛋白和mRNA水平上的表达升高。我们研究了NFκB的经典激活途径：IκBα降解→NFκB转位→与DNA结合。发现内皮细胞经顺铂处理后，IκBα表达下调，NFκB p65蛋白增加，与DNA结合能力增强，最终导致ICAM1表达上调。当然，目前已有的资料表明，人们对顺铂在调节NFκB的活化及其与DNA结合方面尚有争议。本文结果也提示，NFκB在不同肿瘤治疗方案中的反应可因细胞类型和背景的差异而不同，因为许多证据显示，NFκB是一个抗凋亡因子和肿瘤促进因子，而在某些情况下，它又能够促进凋亡。

　　细胞间黏附分子1(ICAM1,CD54)是免疫球蛋白超家族中的一员，它在内皮细胞、淋巴细胞、单核细胞等许多细胞表面呈组成型表达。ICAM1的主要功能是促进白细胞与内皮细胞之间的黏附，从而为应对免疫和病理生理反应而促进白细胞进行组织特异性地定位。直到最近，人们对ICAM1功能的认识仍聚焦于它是白细胞黏附的主要介导因子，但已有证据显示，ICAM1对白细胞滚动和从血管壁渗出也是必要的[13]，而且它还是耦联白细胞黏附作用与下游内皮细胞事件的重要信号分子。

　　白细胞在机体防御反应中的重要作用众所周知。当然，现已逐渐明了，除了这些有益作用外，白细胞也能够对宿主组织产生严重损伤。顺铂所诱导的ICAM1在内皮细胞上的表达上调可能促成了顺铂毒副作用的发生。首先，白细胞-内皮相互作用的增强能够直接或/和间接导致血管损害[7-9]，而血管损害与顺铂引起的肾毒性、耳毒性和神经毒性密切相关。一旦黏附到内皮，中性粒细胞能够释放蛋白酶、有毒的氧代谢产物和血管活性物质，这将引起内皮损伤，进而血管完整性遭到破坏，水肿、出血和组织损伤。其次，基于顺铂的联合化疗方案，包括与抗血管生成药物联合的治疗方案，能够导致血栓发生率的增加，后者至少部分是由于白细胞-内皮间的相互作用增强所引起的，因为中性粒细胞的活化和黏附能够损伤内皮，导致内皮下组织的暴露，这促进了血小板在损伤部位的黏附和聚集。第三，ICAM1的表达上调能够使内皮细胞的通透性增加[14]，这将加剧肿瘤内高液质间压的程度，阻碍化疗药物的递送。另一方面，白细胞在血管壁上的滚动和黏附也是炎症级联反应中的必要步骤。虽然趋化因子和其它诱导性内皮细胞黏附分子如Eselectin或VCAM1也可能在白细胞黏附中起到重要作用，但本实验表明，ICAM1在顺铂引起的白细胞-内皮间的相互作用中占有主导地位,因而ICAM1应该是一个潜在的重要治疗靶点。

　　【参考文献】

　　[1]AbuSurrah AS,Kettunen M.Platinum group antitumor chemistry:design and development of new anticancer drugs complementary to cisplatin[J].Curr Med Chem,2006,13(11):1 337-1 357.

　　[2]Yao X,Panichpisal K,Kurtzman N,et al.Cisplatin nephrotoxicity:a review [J].Am J Med Sci,2007,334(2):115-124.

　　[3]van den Berg JH,Beijnen JH,Balm AJ,et al.Future opportunities in preventing cisplatin induced ototoxicity[J].Cancer Treat Rev,2006, 32(5):390-397.

　　[4]Bianchi R,Brines M,Lauria G,et al.Protective effect of erythropoietin and its carbamylated derivative in experimental Cisplatin peripheral neurotoxicity [J].Clin Cancer Res,2006,12(8):2 607-2 612.

　　[5]Bianchi R,Gilardini A,RodriguezMenendez V,et al.Cisplatininduced peripheral neuropathy:neuroprotection by erythropoietin without affecting tumour growth[J].Eur J Cancer,2007,43(4):710-717.

　　[6]de Vos FY,Willemse PH,de Vries EG,et al.Endothelial cell effects of cytotoxics:balance between desired and unwanted effects[J].Cancer Treat Rev,2004,30(6):495-513.

　　[7]Kohn S,Fradis M,Podoshin L,et al.Endothelial injury of capillaries in the stria vascularis of guinea pigs treated with cisplatin and gentamicin[J].Ultrastruct Pathol,1997,21(3):289-299.

　　[8]Kohn S,Fradis M,BenDavid J,et al.Nephrotoxicity of combined treatment with cisplatin and gentamicin in the guinea pig:glomerular injury findings[J].Ultrastruct Pathol,2002,26(6):371-382.

　　[9]Kirchmair R,Walter DH,Ii M,et al.Antiangiogenesis mediates cisplatininduced peripheral neuropathy:attenuation or reversal by local vascular endothelial growth factor gene therapy without augmenting tumor growth[J].Circulation,2005,111(20):2 662-2 670.

　　[10]Li S,Gokden N,Okusa MD,et al.Antiinflammatory effect of fibrate protects from cisplatininduced ARF [J].Am J Physiol Renal Physiol,2005,289(2):F469-480.

　　[11]Sundelin K,Roberg K,Grenman R,et al.Effects of cisplatin,alphainterferon,and 13cis retinoic acid on the expression of Fas (CD95),intercellular adhesion molecule1 (ICAM1),and epidermal growth factor receptor (EGFR) in oral cancer cell lines [J].J Oral Pathol Med,2007,36(3):177-183.

　　[12]Ramesh G,Reeves WB.TNFalpha mediates chemokine and cytokine expression and renal injury in cisplatin nephrotoxicity [J].J Clin Invest,2002,110(6):835-842.

　　[13]Ley K,Laudanna C,Cybulsky MI,et al.Getting to the site of inflammation:the leukocyte adhesion cascade updated [J].Nat Rev Immunol,2007,7(9):678-689.

　　[14]Clark PR,Manes TD,Pober JS,et al.Increased ICAM1 expression causes endothelial cell leakiness,cytoskeletal reorganization and junctional alterations [J].J Invest Dermatol,2007,127(4):762-774.