粉防己碱抑制人卵巢癌HO-8910细胞生长的研究

　　作者：汤艳 作者单位：锦州市中心医院妇产科，辽宁 锦州 121001

　　【摘要】 目的 探讨粉防己碱对人卵巢癌细胞株HO-8910增殖与凋亡的作用。方法 MTT 法测定细胞增殖情况;吖啶橙荧光染色(AO)观察细胞凋亡的形态学变化;流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡。结果 粉防己碱对HO-8910细胞有抑制增殖作用,呈时间、剂量依赖性;光镜可观察到细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术检测结果分析，实验组G1/G0期上升，S期和G2/M期下降，细胞凋亡率上升。结论 粉防己碱在体外能抑制卵巢癌HO-8910细胞增殖，诱导HO-8910细胞发生凋亡。

　　【关键词】 粉防己碱 卵巢癌 增殖 凋亡

　　A Study on Effects of Tetrandrine on Inhibiting Growth of

　　Ovarian Cancer Cell HO-8910 TANG Yan1，REN Sheng-ping2

　　(1.Department of Obstetrics and Gynaecology, Jinzhou Central Hospital, Jinzhou 121001 China;

　　2. Department of Health and Education in Shenyang, Shenyang 110000 China)【Abstract】 Objective To study the effect of tetrandrine on proliferation and apoptosis of ovarian cancer cell HO-8910 in vitro. Methods The proliferation of cells was detected by MTT method. Morphological and ultrastructure changes were observed by AO staining. Cell cycle and apoptotic percentage were analyzed by flow Cytometry (FCM). Results Tetrandrine could inhibit the proliferation of HO-8910 cells directly related to concentration and time. Apoptosis morphology was observed in Tetrandrine groups. The flow cytometry showed that the proportion of G1/G0 phase and the apoptotic rate were increased significantly in Tetrandrine groups, the proportions of S phase and G2/M phase were reduced. Conclusions Tetrandrine can induce the apoptosis of ovarian cancer and inhibit cell proliferation.

　　【Key words】 tetrandrine; ovarian cancer; proliferation; apoptosis

　　粉防己碱(Tetrandrine)别名称汉防己甲素,是从中草药粉防己的块根中提取的双苄基异喹啉类生物碱,对高血压、心律失常、肺纤维化等疾病具有较好的疗效。近年来的研究表明,粉防己碱可抑制多种肿瘤细胞生长,作为一种潜在的抗肿瘤药物,其相关研究颇受关注。卵巢癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，其死亡率高居妇科肿瘤之首，术后化疗仍是卵巢癌最重要的辅助治疗措施，但由于化疗的毒副作用及肿瘤抗药性的增加其疗效显著降低，我们从抗肿瘤的植物药中，筛选出粉防己碱，观察其对卵巢癌HO-8910细胞的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人卵巢癌细胞株HO-8910(中科院上海细胞所提供);粉防己碱(江西银涛药业有限公司)，25℃溶于DMSO中;胰蛋白酶、RPMI-1640、吖啶橙、胎牛血清(华美生物公司);MTT及二甲亚砜DMSO(sigma公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 人卵巢癌HO-8910细胞株，培养基为RPMI-1640内含10%灭活胎牛血清、37℃、5%二氧化碳的饱和湿度培养传代。

　　1.2.2 实验分组 共分5组：实验组：加入粉防己碱，终浓度分别为1.0mg/L,5.0 mg/L，10.0 mg/L及20.0 mg/L组;对照组：加入等量的RPMI-1640培养液(每组设6个复孔)。

　　1.3 实验指标的检测

　　1.3.1 MTT试验

　　取对数生长期的HO-8910细胞，制成浓度为1×105个/mL的单细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔200μL，过夜贴壁后;实验组加入1.0mg/L, 5.0 mg/L，10.0 mg/L及20.0 mg/L的粉防己碱，对照组加等量的RPMI-1640。每组设6个复孔，继续培养24、48h后加入MTT(5mg/mL) 20μL/孔，4h后吸净上清液，加入DMSO 20μL/孔，震荡10min，用酶标记光仪在波长为560nm时测定每孔的吸光度(A)值，计算不同浓度抗体对细胞增殖的抑制率[抑制率=(对照组A均值-实验组的A均值) /对照组A均值 [1]]。

　　1.3.2 AO染色

　　取对数生长期的HO-8910细胞，制成浓度为5×105个/mL的单细胞悬液，按上述粉防己碱浓度培养48h后，离心弃上清，用PBS洗3次，95%乙醇固定15～30min;1%醋酸酸化30s;加入0.01%AO染色1～5min，封片，镜下观察并摄影。

　　1.3.3 流式细胞仪检测细胞周期

　　取对数生长期的HO-8910细胞，制成浓度为1×106个/mL的单细胞悬液，按上述浓度培养24h后，收集细胞，PBS洗涤，制成单细胞悬液，用70%的冰乙醇4℃固定12h，用含核糖核酸酶及碘化丙锭的染液染30min，上流式细胞仪进行检测。

　　1.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率

　　取对数生长期的HO-8910细胞，制成浓度为1×106个/mL的单细胞悬液，接种于6孔培养板中，按上述浓度培养24h后，收集细胞，用AnnexinV-FITC/PI双标记染色后做流式细胞仪双色分析。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，所有数据均用±s表示，统计方法采用方差分析，组间比较采用q检验。

　　2 结 果

　　2.1 MTT试验结果

　　实验结果显示：粉防己碱对HO-8910细胞的生长具有明显的抑制作用, 实验范围内最大抑制率达61.35%，且抑制作用随药物浓度增加、作用时间延长而增强，呈现剂量、时间依赖性作用, 经统计学检验差异具有显著性意义(P< 0.01，见表1)。

　　表1 实验组和对照组卵巢癌细胞内的吸光度值和增殖抑制率(±s)组别粉防己碱

　　(mg/L)24h吸光度值(±s)抑制率(%)48h吸光度值(±s)抑制率(%)对照组00.605±0.00600.608±0.0050实验组10.562±0.004*△7.110.535±0.003*△12.0150.508±0.009*△16.030.420±0.005*△30.92100.450±0.008*△25.620.325±0.003*△46.55200.333±0.008*△44.960.235±0.003*△61.35

　　注：同一作用时间采用方差分析及q检验*P<0.01;同一浓度组采用t检验△P<0.05

　　2.2 AO染色

　　凋亡细胞体积明显缩小，核碎裂，核内可见浓缩边集的染色质，呈新月形或肾形致密浓染的黄绿色染色，荧光亢进 (图1)。

　　2.3 粉防己碱对卵巢癌细胞周期分布和凋亡率的影响

　　不同浓度粉防己碱作用卵巢癌细胞24h后，与对照组相比，细胞周期分布、凋亡率均发生改变，即G1/G0期细胞比例数上升，S期和G2/M期下降，细胞凋亡率上升，均有显著差异(P<0.05)，且与粉防己碱浓度之间具有剂量依赖性(P<0.05，见表2)。

　　表2 粉防己碱对卵巢癌细胞周期分布和凋亡率的影响(±s)注：采用方差分析*P<0.01

　　3 讨 论

　　粉防己碱是一种具有广泛药理学作用的双苄基异喹啉类生物碱，是粉防己的主要有效成分。早期研究表明粉防己碱具有消炎、镇痛、降压、抗纤维化等广泛的药理作用。近年来的研究证实粉防己碱是天然的非选择性的钙通道阻滞剂，又是钙调蛋白的拮抗剂，具有直接抗肿瘤的作用。Kuo等[2]发现，粉防己碱不仅抑制人肝癌Hep G2细胞株的生长，还可诱发凋亡。何琪扬[3]等采用台盼蓝计数法发现粉防己碱对敏感急性白血病细胞株HL260和抗三尖杉酯碱的HL-60细胞均有生长抑制作用。王瑞珍[4]等用粉防己碱处理人食管癌细胞，观察到肿瘤细胞分裂指数低于对照组约50%。Dong Y[5]等观察到粉防己碱可抑制HL260细胞生长,认为粉防己碱可通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤细胞生长。

　　本研究也发现,粉防己碱明显抑制人卵巢癌HO-8910细胞的生长。本实验采用MTT法检测不同时间和剂量的粉防己碱对体外培养的HO-8910细胞增殖的影响。结果证实粉防己碱对HO-8910细胞的增殖具有显著抑制作用，且呈时间、剂量依赖性。流式细胞仪检测细胞周期显示随着粉防己碱的浓度的增大，G1/G0期比例升高，S期、G2/M期降低，提示粉防己碱具有G1/G0期阻滞作用，使进入S期细胞明显减少，阻碍细胞进入DNA合成期。粉防己碱阻止卵巢癌细胞周期的进展,说明粉防己碱抑制卵巢癌HO-8910细胞增殖可能与其阻滞细胞周期的有序进行有关，从而诱导卵巢癌细胞的调亡。流式细胞仪检测卵巢癌细胞凋亡率亦表明：粉防己碱随浓度的增大其对HO-8910细胞的凋亡率增大，呈剂量依赖关系，且与对照组比较均具有显著差异(P<0.01)。AO染色也观察到了凋亡细胞的形态学变化。

　　本研究为临床应用粉防己碱治疗恶性肿瘤提供了一定的实验依据。粉防己碱毒副作用小, 对肝肾功能无损害,无骨髓抑制，是一种有效且较安全的抗肿瘤药物,而且我国有丰富的中草药资源,利用现代科学技术可使其发挥更大的作用。(此文图1见附页2)

　　【参考文献】

　　[1] 司徒镇强，吴军正.细胞培养[M].西安：世界图书出版公司，1996:138.

　　[2] Kuo PI, Lin CC.Tetrandrine-induced cell arrest and apoptosis in Hep G2 cell [J].Life Sciences,2003,73(2):243-252.

　　[3] 何琪扬,张鸿卿,庞大本,等.抗三尖杉酯碱的HL-60细胞抗粉防己碱诱导的细胞凋亡[J].中国药理学报,1996,17(6):545-549.

　　[4] 王瑞珍,潘琼婧.汉防己甲素对体外培养人食管癌上皮细胞增殖的影响[J].中华肿瘤杂志,1981,3(2):86-88.

　　[5] Dong Y, Yang MM, Kwan CY.In vitro inhibition of proliferation of HL-60 cells by tetrandrine and coriolusversi colorpep tide derived from Chinese medicinal herbs [J].Life Sci,1997,60(8):135-140.