瘦素受体在实验性多囊卵巢综合征大鼠卵巢中的表达及其意义

　　作者：苏艳华， 王雪金 作者单位：福建医科大学 1.附属协和医院 妇产科，福州 350001;2.附属第二医院 妇产科，泉州 362000

　　【摘要】 目的 研究来曲唑诱导建立多囊卵巢综合征(PCOS)动物模型中卵巢组织瘦素受体(ObR)及其mRNA的表达，探讨卵巢ObR变化与PCOS发病机制的关系。 方法 6周龄清洁级雌性SD大鼠45只，分为正常组、溶剂组和来曲唑组，各15只。正常组每日自由摄取食物和水;溶剂组每日给予1%羟甲基纤维素水溶液2 mL/kg灌胃;来曲唑组以来曲唑0.5 mg/kg灌胃。观察大鼠体质量、动情周期、卵巢质量及其形态学改变，测定血清黄体生成素(LH)、睾酮(T)、胰岛素(INS)、瘦素(LEP)及血糖(FG)水平，采用免疫组织化学和Real Time RTPCR方法检测大鼠卵巢中ObR及其mRNA的相对表达，并对3组的各指标进行比较。 结果 来曲唑组大鼠体质量和卵巢质量指数升高，动情周期消失，卵巢体积增大，白膜增厚，HE染色可见较多囊状扩张的卵泡且黄体数量明显下降，血清T、LH、INS、LEP水平明显升高(P<0.05);卵巢ObR及其mRNA表达明显增强(P<0.05)。 结论 来曲唑诱导建立的PCOS动物模型临床表现与人类似;卵巢中ObR表达上调，可能是导致PCOS患者不排卵、生育力下降的原因之一。

　　【关键词】 多囊卵巢综合征; 卵巢; 瘦素; 受体，肽; 疾病模型，动物

　　多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是生育年龄妇女常见的内分泌紊乱性疾病，以卵巢的功能紊乱为特征，常表现为不孕和肥胖，但其发病原因目前尚无定论。瘦素(leptin，LEP)是肥胖基因(ob基因)的表达产物，近年来的研究认为, LEP是营养与生殖之间的代谢信号，它在生殖方面有许多重要的调节作用[12]。研究还显示，LEP存在于卵泡液中,且LEP受体(ObR)在人卵巢中几种不同的细胞上也有表达，表明LEP能够对性腺行使直接的作用[3]。笔者通过研究PCOS大鼠卵巢中ObR及其mRNA的表达情况，探讨其与PCOS发病机制的关系，现报告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 PCOS动物模型 6周龄清洁级雌性SD大鼠，购自中国科学院上海实验动物中心[许可证号：SCXX(沪)20070005]，平均体质量180 g，二级动物房饲养，恒温22 ℃，光照12 h、黑暗12 h交替，自由摄取食物和水。每日定时作阴道涂片检查，选择动情周期4～5 d，连续2个正常动情周期的大鼠即开始用于实验，共选出45只，分为正常组、溶剂组和来曲唑组，各15只。来曲唑组每日给予溶解在1%羟甲基纤维素水溶液(CMC)2 mL/kg的来曲唑(芙瑞，江苏恒瑞医药股份有限公司)0.5 mg/kg灌胃，连续21 d[45];正常组每日自由摄取食物和水;溶剂组每日给予CMC 2 mL/kg灌胃。

　　1.2 大鼠体质量及动情周期 每日同一时间称量大鼠体质量，同时进行阴道脱落细胞涂片，瑞氏染色后显微镜下观察细胞形态的变化，确定大鼠动情周期的情况。

　　1.3 大鼠血清中各项指标 末次给来曲唑24 h后，禁食8 h，对所有大鼠进行下腔静脉取血，采用放射免疫分析法测定大鼠血清黄体生成素(LH)、睾酮(T)及胰岛素(INS)、LEP，试剂盒购自天津市协和医药科技有限公司，批内和批间变异系数分别<10%和<15%。血糖(FG)测定采用葡萄糖氧化酶法，计算胰岛素敏感指数(HomaIR)：

　　HomaIR=FG×FINS/22.5

　　1.4 卵巢标本采集及处理 腹腔注射水合氯醛(0.3 mL/100 mg)麻醉，打开腹腔，用去RNA酶处理过的机械取出双侧卵巢，去除表面脂肪组织并称质量，一侧用10%中性福尔马林固定后石蜡包埋，留作光镜下(HE染色)观察卵巢形态学改变和免疫组织化学实验;另一侧存于-80 ℃冰箱，留作PCR检测。

　　1.5 卵巢中ObR表达 常规石蜡包埋，连续冠状切片，厚4 μm，共3套，分别用于HE染色、免疫组织化学染色及其对照试验。按Elivision免疫组织化学方法进行操作，一抗为羊抗兔LEP受体抗体1∶100(北京中杉金桥生物技术有限公司)，25 ℃过午;二抗50 μL为羊抗兔(福州迈新生物技术开发有限公司)30 min，DAB显色3～5 min，苏木素复染1 min。结果判定参照文献[6]，阳性为细胞内出现黄色颗粒。按染色强度与阳性细胞百分数判定，>50%细胞着棕黄色为强阳性，评3分;<50%细胞着棕黄色或>50%着黄色为阳性，评2分;<50%细胞着黄色或均着淡黄色为弱阳性，评1分;不着色为阴性，评0分。每个标本观察8个视野，双盲法评估结果。

　　1.6 卵巢中ObR mRNA的表达

　　1.6.1 总RNA提取 每100 mg组织加1.0 mL的Trizol溶液，充分研磨组织后，室温静置5 min。加0.2 mL氯仿用力振荡15 s，室温静置5 min。4 ℃，12 000 r/min离心15 min。吸上清，加入等体积(约0.5 mL)的异丙醇，混匀后室温静置10 min，12 000 r/min离心10 min。弃上清，留取沉淀。加1 mL现配的75%的乙醇(预冷)振荡洗涤RNA沉淀1次，12 000 r/min离心5 min。弃上清，加20 μL的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解RNA。

　　1.6.2 Real Time RTPCR 采用Takara 公司SYBR PrimeScript RTPCR Kit(Perfect Real Time)，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成：

　　ObR(125 bp)：

　　F：5’GTTCCAAACCCCAAGAATTG3’

　　R：5’TCAGGCTCCAGAAGAAGAG3’

　　βactin(170 bp)：

　　F：5’CTAAGGCCAACCGTGAAAAG3’

　　R：5’ACCCTCATAGATGGGCACAG3’

　　1.6.3 产物鉴定 取5 μL PCR产物加1 μL上样缓冲液加样，于2%琼脂糖凝胶上进行电泳，以50～500 bp DNA ladder作为Marker。电泳电压125 V，凝胶图像分析仪(Del Doc1000，美国BioRAD公司)分析并摄像，观察PCR扩增结果。

　　1.6.4 实时定量PCR结果 采用比较阈值法测定目的基因的相对表达[7]：

　　目的基因的相对表达量=2_△△Ct，

　　△△Ct=(△Ct，目的基因△Ct，内参基因)实验组(△Ct，目的基因△Ct，内参基因)对照组

　　每份样本均重复2次，取其平均值。

　　1.7 统计学处理 数据以SPSS 13.0统计软件进行处理。大鼠体质量用x±s表示，各组之间差别采用单因素方差分析;卵巢质量和血清各项指标均以中位数表示，各组之间的比较采用非参数检验-秩和检验

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠体质量和卵巢质量比较 给药前3组大鼠体质量比较，差别无统计学意义(P>0.05);模型建立21 d后，来曲唑组的大鼠体质量和卵巢质量指数均明显升高,与正常组及溶剂组比较，差别均有统计学意义(P<0.05，表1)。表1 模型建立后大鼠体质量和卵巢质量指数的比较 卵巢质量指数=卵巢质量/大鼠体质量×100. 与正常组比较，▲：P<0.05.

　　2.2 大鼠动情周期 正常组和溶剂组阴道脱落细胞变化符合正常大鼠动情周期，来曲唑组在给药第5天起，陆续出现动情周期消失，且均处动情间期时相，即仅见大量白细胞，偶见少量角化细胞，提示无排卵。

　　2.3 卵巢组织学变化 肉眼观察：正常组和溶剂组表现为卵巢色泽红，未见囊状扩张卵泡;来曲唑组为卵巢表面苍白，白膜增厚，体积增大，可见较多囊状扩张的卵泡。组织切片HE染色，正常组和溶剂组示多个黄体及不同发育阶段的卵泡，卵泡内颗粒细胞呈多层，多为8～9层，卵巢白膜较薄(图1A，1B);来曲唑组示有早期发育的较多的小卵泡及闭锁卵泡，囊状扩张卵泡明显增加，颗粒细胞层数减少至2～3层，卵泡内卵母细胞或放射冠消失，黄体数量明显下降并伴有不完全的黄素化，卵巢白膜较厚(图1C)。

　　2.4 血清中各项指标测定 来曲唑组大鼠血清中INS、T、LH、LEP、HOMAIR明显高于正常组和溶剂组(P<0.05)，正常组和溶剂组之间比较无统计学意义(P>0.05)，见表2。表2 各组血清中各项指标的测定结果FG：血糖;INS：胰岛素;T：睾酮;LH：黄体生成素;LEP：瘦素;HOMAIR：胰岛素敏感指数. 与正常组比较，☆：P<0.05. A：正常组(×100)：多个黄体及不同发育阶段的卵泡，卵泡内颗粒细胞呈多层，卵巢白膜较薄;B：溶剂组(×400)：卵泡内颗粒细胞呈多层，多为8～9层;C：来曲唑组(×100)：有早期发育的较多的小卵泡及闭锁卵泡，囊状扩张卵泡明显增加，颗粒细胞层数减少至2～3层，卵泡内放射冠消失，黄体数量明显下降并伴有不完全的黄素化，卵巢白膜增厚.

　　2.5 卵巢中ObR的表达情况 根据染色强度与阳性细胞百分数半定量评分,来曲唑组大鼠卵巢ObR相对表达量[2.5(2～3)]明显高于正常组[1(1～2)]和溶剂组[1(1～1.75)]，差别具有统计学意义(P<0.05，图2);而正常组和溶剂组之间差别无统计学意义(P>0.05)。

　　A：正常组;B：溶剂组;C：来曲唑组. ObR阳性染色者在细胞质和/或细胞膜中可见棕黄色和/或黄色着色颗粒, 阳性细胞分布不均匀, 多呈散在片状或灶状分布，细胞核未见阳性细胞染色，来曲唑组其阳性表达明显强于正常组和溶剂组.

　　2.6 卵巢中ObR mRNA表达结果 PCR产物电泳进行产物鉴定，扩增片段大小和设计的内参基因(170 bp)和目的基因(125 bp)扩增长度一致(图3)。实时荧光相对定量分析结果如表3所示，卵巢中ObR mRNA在来曲唑组的表达均显著高于正常组和溶剂组(P<0.01)。

　　3 讨 论

　　PCOS主要表现为稀发排卵或者不排卵，生育力低下，是引起女性不排卵性不孕的主要原因。LEP是由肥胖基因编码的16 kD的糖基化蛋白，除参与调节机体能量代谢和脂肪聚集外，还参与神经、内分泌和生殖系统的调节。ObR在中枢和外周组织均有选择性表达，包括下丘脑、脂肪组织、卵巢、睾丸等组织，LEP通过结合靶组织上的ObR激ObR:瘦素受体. 1：marker;2：βactin;3：ObR.

　　活胞内信号传导因子及转录家族蛋白后发挥作用。国外报道在卵巢中未检测到ob基因的表达，提示卵巢本身并不产生LEP，卵泡液中的LEP来源血清[8]。表3 大鼠卵巢中ObR mRNA实时荧光相对定量PCR结果

　　LEP作为一种旁分泌因子，通过其受体直接作用于卵巢颗粒细胞而参与卵巢功能的调节，因此笔者考虑PCOS卵巢的改变可能与LEP及其受体的异常调控存在某些联系。Panidis等研究发现，PCOS可能与循环LEP水平的异常调节有关，PCOS妇女的生殖功能可能比相同体质量的无PCOS的正常妇女更易受LEP的影响[9];另外,在PCOS患者的卵巢，可能存在固有的LEP反应异常，这种异常可能是由于其卵巢内的分泌异常，或受体水平、受体后信号传导的单个或多个内在缺陷所致靶细胞对LEP反应异常，故ObR在卵巢内的作用可能有更深远的意义。

　　本实验采用来曲唑诱导建立PCOS大鼠模型。来曲唑为一种非甾体类芳香化酶抑制剂，它能使T和雄烯二酮在芳香化酶的作用下转变成雌二醇和雌酮的过程受到抑制，导致雄激素水平升高并发展为多囊卵巢[10]。结果表明，本实验建立的PCOS动物模型均表现出类似人PCOS的临床特征，主要表现为大鼠体质量升高、动情周期失去规律性变化，血清学提示有高雄激素、高胰岛素、高LEP及胰岛素抵抗的改变，卵巢体积及质量增加，肉眼见卵巢表面较苍白，白膜增厚，较多囊状扩张的卵泡，镜下见较多的小卵泡，闭锁卵泡，囊状扩张卵泡明显增加，颗粒细胞层数2～3层，卵泡内卵母细胞或放射冠消失，黄体数量明显下降并伴有不完全的黄素化，故认为用来曲唑诱导的动物模型是较理想的PCOS大鼠动物模型，符合实验需要。

　　近来有研究发现，在不同发育阶段的卵泡检测到LEP mRNA的阳性信号,提示LEP可能参与卵巢的类固醇激素分泌功能。而PCOS患者原始卵母细胞LEP高表达，提示其异常的卵巢状态可能与卵巢水平的LEP异常分泌有关，可能同时存在受体或受体后水平的调节异常[11]。本实验从ObR的角度出发，探讨受体调节对PCOS异常卵巢状态的影响。实验发现来曲唑组大鼠血清中LEP明显升高，免疫组织化学结果证实在大鼠卵巢中有ObR的表达，并运用免疫组织化学半定量评分和Real Time RTPCR检测均得出来曲唑组卵巢ObR表达较正常组升高的结果。Sirotkin等报道人卵巢颗粒细胞体外培养的过程中，LEP能直接抑制胰岛素样生长因子I(IGFI)对协同FSH促颗粒细胞合成E2的作用，提示LEP对卵巢功能有抑制作用，有可能阻断优势卵泡的选择及卵泡发育，导致无排卵发生[12]。近来有研究发现，在性未成熟的大鼠,给予高剂量的LEP，可降低血浆孕酮、卵巢前列腺素E的水平,也降低排卵率，体外培养的排卵前卵泡及卵巢组织块的研究也显示了同样的结果，即降低排卵率、降低孕酮和卵巢前列腺素E的释放。表明高剂量LEP作用于受体可抑制排卵，也可能是由于直接或间接影响前列腺素、氧化亚氮等卵巢因子而引起[13]。本研究中检测出PCOS大鼠卵巢ObR表达显著升高，结合血清LEP的升高和卵巢的病理改变，也提示高剂量LEP作用于受体可抑制排卵。Yin等对体外培养的正常及具有PCOS肥胖女性黄体颗粒细胞的研究表明，LEP增加体外培养的正常黄体颗粒细胞ObR mRNA的表达，且当LEP浓度在100 ng/mL时，ObR mRNA的表达达到高峰[14]，说明具有PCOS的肥胖女性，其血清LEP浓度增高，可促进黄体颗粒细胞ObR表达增高，进而增加对LEP的敏感性，这可能与PCOS肥胖女性排卵停止有关。因此，笔者认为实验中PCOS大鼠卵巢ObR表达异常增强，将激活更多LEP发挥作用，增强对卵巢功能的抑制，导致PCOS不排卵，以至于生育力下降。

　　ObR及其mRNA在卵巢的定位表达表明LEP通过ObR对卵巢功能有直接的影响。PCOS大鼠卵巢中ObR表达增强，导致LEP对卵巢功能的抑制增强，直接参与PCOS发病机制中卵巢功能的异常调节，至于是否存在受体后信号传导的异常尚需进一步研究得以证实。

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