基质金属蛋白酶2及其抑制因子TIMP2在脑胶质瘤中的表达及意义

　　作者：周任，柏鲁宁，王睿智，张龙洲，包新杰，曹杰 作者单位：1. 西安交通大学医学院第二附属医院神经外科，陕西西安 710004;2. 陕西中医学院附属医院神经外一科，陕西咸阳 712000

　　【摘要】目的 探讨基质金属蛋白酶2(MMP2)及其抑制因子TIMP2的表达及其与脑胶质瘤恶性程度之间的关系。方法 采用免疫组化SP法检测并比较了67例不同级别胶质瘤组织和10例正常脑组织中MMP2和TIMP2蛋白的表达情况。结果 随着肿瘤恶性程度的增加，MMP2蛋白表达增高而TIMP2蛋白表达降低。结论 MMP2及TIMP2对胶质瘤恶性程度的评估有重要的意义。

　　【关键词】 基质金属蛋白酶;基质金属蛋白酶抑制因子;神经胶质瘤

　　Expression of MMP2 and its inhibitor TIMP2 in human glio

　　maZhou Ren, Bai Luning, Wang Ruizhi, Zhang Longzhou, Bao Xinjie, Cao Jie

　　1. Department of Neurosurgery, the Second Affiliated Hospital, Medical School ofXian Jiaotong University, Xian 710004;

　　2. Department of Neurosurgery,the Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medical College, Xianyang 712000, China

　　ABSTRACT: Objective To explore the expression of matrix metalloproteinase2 (MMP2) and its inhibitor tissue inhibitor of metalloproteinase2 (TIMP2) and their relation with glioma of different malignancy degree. Methods Immunohistochemical SP method was employed to examine the level of MMP2 and TIMP2 in surgical samples from 67 patients suffering from gliomas and 10 patients with cerebral trauma. Results As the tumors malignancy degree increased, the expression of MMP2 increased but the expression of TIMP2 decreased as the tumor malignancy degree increased. Conclusion MMP2 and TIMP2 have a great significance in evaluating the malignancy degree of human gliomas.

　　KEY WORDS: matrix metalloproteinases2 (MMP2); tissue inhibitor of metalloproteinase2 (TIMP2); glioma

　　人脑胶质瘤是危害人类健康的常见恶性肿瘤，约占颅内肿瘤的40%-50%。目前，以手术治疗为主辅以放疗、化疗的综合治疗总体疗效欠佳，而造成这一现象的一个重要原因就是胶质瘤所具有的侵袭性生长特性[1]。

　　目前，认为在脑胶质瘤侵袭性生长过程中，起关键作用的是一类基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase, MMPs)。MMPs在人体内表达的水平及其活性受诸多因子的调节，特别与其特异性组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMPs)关系密切，可以说MMPs与TIMPs在人脑胶质瘤中表达情况直接关系到胶质瘤侵袭性的强弱。本研究采用免疫组化的方法，检测了人脑胶质瘤中MMP2和TIMP2蛋白表达情况，并探讨其与胶质瘤恶性程度之间的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料

　　本组67例神经胶质瘤标本均为2004年至2006年我院手术切除的石蜡包埋标本(观察组)。其中男40例，女27例;年龄20-69岁，平均(43.07±7.23)岁。患者术前均未行放、化疗。全部脑胶质瘤组织均经病理组织学检查明确诊断。根据WHO分级和分类标准[2]：Ⅰ级17例，Ⅱ级10例，Ⅲ级22例，Ⅳ级18例。同期收集10例脑挫裂伤开颅减压者的正常脑组织作为对照(对照组)。

　　1.2 主要试剂与仪器

　　鼠抗人MMP2、TIMP2一抗均购自Maixinbio公司;SP免疫组化试剂盒、DAB显色剂、多聚赖氨酸等购自武汉博士得生物公司;主要仪器有水浴锅、微波炉、显微镜等。

　　1.3 MMP2、TIMP2蛋白的检测

　　采用免疫组化SP法。肿瘤标本常规二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水后以3%(体积分数)H2O2、37℃孵育10min，PBS冲洗2-3次各5min;然后将标本置于0.01mol/L枸橼酸缓冲液中行抗原修复，在正常羊血清工作液封闭10min后倾去血清，滴加鼠抗人MMP2和TIMP2一抗，4℃冰箱孵育过夜;PBS冲洗5min后滴加生物素标记二抗，孵育30min后以PBS冲洗;最后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS冲洗3次各5min，DAB反应显色后自来水充分冲洗、苏木素复染。常规行脱水、透明、干燥封片后镜下观察。用已知MMP2、TIMP2表达阳性的切片作阳性对照，PBS代替一抗孵育已知阳性的切片作阴性对照。

　　1.4 结果判定标准

　　MMP2和TIMP2蛋白染色主要位于胞质，极少数有胞核着色，光镜下呈棕黄或棕褐色。每张切片高倍镜下(×400)随机观察5个视野，对染色阳性细胞计数。阳性细胞占总细胞的比率<10%为“-”，10%-25%为“+”，25%-50%为“”，>50%为“”。

　　1.5 统计学处理

　　应用SPSS12.0统计软件分析数据。组间比较采用χ2检验，相关性检验采用Spearman相关分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MMP2在脑胶质瘤中的表达

　　SP免疫组化显示，正常脑组织中少有MMP2表达，而胶质瘤中MMP2在胞核、胞质中均有表达，以胞质为主(图1)。两组MMP2阳性率比较差异具有统计学意义(P<0.05)。且MMP2的阳性率随着肿瘤级别的增高而增高，Ⅰ、Ⅱ级同Ⅲ、Ⅳ级相比差异有统计学意义(P<0.05);Ⅰ、Ⅱ级，Ⅲ、Ⅳ级组间比较无统计学意义(P>0.05，表1)。

　　2.2 TIMP2在脑胶质瘤中的表达

　　TIMP2在正常脑组织少有染色，在胶质瘤中阳性染色位于肿瘤胞质中。染色阳性细胞多呈散在性分布且多位于血管周围，光镜下呈棕黄或深黄色(图2)。两组TIMP2阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)。在胶质瘤组其阳性率随着肿瘤的恶性程度增加而下降;Ⅰ、Ⅱ级同Ⅲ、Ⅳ级相比较差异有统计学意义(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ级，Ⅲ、Ⅳ级组间比较差异无统计学意义(P>0.05，表1)。表1 MMP2、TIMP2在不同级别脑胶质瘤中的表达(略)

　　2.3 MMP2、TIMP2的相关性分析

　　MMP2、TIMP2在正常脑组织中均较少表达，在胶质瘤中两者表达呈负相关，差异具有统计学意义(r=-0.85，P<0.05)。

　　3 讨 论

　　神经胶质瘤是颅内最为常见的原发性恶性肿瘤，具有恶性程度高、易复发、预后差等临床特点。临床研究发现，胶质瘤除直接向临近脑组织浸润外更常见的是瘤细胞沿血管基底膜及白质纤维侵袭生长。在脑胶质瘤侵袭微生态系统中，肿瘤细胞是肿瘤侵袭微生态系统(tumor invasive microeco system, TIMES)的启动因素。瘤细胞与细胞外基质(extracellular marix, ECM)黏附后使相关组织分泌基质降解酶，致局部正常脑组织被降解，形成局部侵袭生长，是恶性胶质瘤的主要特征之一[3]。

　　肿瘤发生侵袭和转移的重要步骤是肿瘤细胞突破细胞外基质及基膜。而Ⅳ型胶原是基膜的重要组成成分，Ⅳ型胶原为具有独特螺旋结构的蛋白质。目前，发现只有Ⅳ型胶原酶才能降解。已知的两种Ⅳ型胶原酶分别为MMP2(分子质量72ku)和MMP9(分子质量92ku)。ECM的降解过程主要依靠MMP2起作用。MMP2属于MMPs家族中的明胶酶类，TIMP2是MMP2的天然抑制物，两者的表达水平比例的高低决定了ECM的降解程度，也决定了肿瘤细胞侵袭性生长的程度[4]。

　　本研究结果发现，MMP2在胞核、胞质中均有表达，其阳性率随着肿瘤级别的增高而增高;TIMP2阳性染色位于肿瘤胞质中，阳性细胞多呈散在性分布，其阳性率随着胶质瘤的恶性程度增加而下降;大部分正常脑组织中未见MMP2和TIMP2染色。Thei等[5]研究发现MMPs的表达与胶质瘤的恶性程度成正相关，即那些分化不良的肿瘤细胞比分化良好的肿瘤细胞产生更多的MMPs，而TIMPs对MMPs的表达调控起着很重要的作用。Lu等[6]也发现，MMP2与胶质瘤的侵袭性有很大的相关性，具有侵袭能力的胶质瘤细胞分泌大量的MMP2，其侵袭能力同MMP2表达水平之间存在正相关，随着胶质瘤恶性程度的增高，MMP2转录和表达水平亦明显上调。以上研究均表明MMP2在胶质瘤的侵袭性中可能发挥重要作用。

　　MMPs通过降解细胞外基质为肿瘤细胞的侵袭提供了保障，同时通过信号转导的级联激活机制，增加与细胞外基质相结合的生长因子的流动性和可溶性。此外MMPs可分解并激活其他生长因子，而这些生长因子参与了胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)的侵袭性生长与增殖(如TGFβ)[7]。近年来大量研究亦证实，MMPs在胶质瘤血管形成中起关键作用。应用特异性抑制因子TIMPs抑制其活性，可阻止局部肿瘤播散及新生血管形成[8]。Megumi等[9]用C6细胞株在鼠体内培养成脑胶质瘤的活体模型，研究发现胶质瘤可诱导MMP2的合成与活化，而活化的MMP2不但在宿主组织中促使新生血管形成，而且能维持新生血管结构的完整性。与对照组比较，TIMP2处理组中胶质瘤体积明显缩小(P<0.05)，且伴随血管变性及缺血性坏死。而且与野生型大鼠比较，MMP2缺陷型大鼠的肿瘤体积明显较小。因此，TIMPs可以延缓或抑制肿瘤的发展可能为胶质瘤治疗提供新方向。

　　总之，MMP2在脑胶质细胞瘤的发生、发展和侵袭性生长中扮演着重要角色，MMP2的高表达与胶质瘤的恶性程度呈正相关;MMP2与TIMP2的平衡失调与胶质瘤的恶性程度和侵袭性密切相关。全面了解MMPs及其抑制剂TIMPs在人胶质瘤侵袭性生长中的作用机制可望为胶质瘤的抗侵袭性治疗提供新的思路和方向。

　　【参考文献】

　　[1]章薇, 费舟, 章翔. 基质金属蛋白酶在脑胶质细胞瘤研究中的应用前景 [J]. 中华神经外科疾病研究杂志, 2006, 5(2):183187.

　　[2]王忠诚. 王忠诚神经外科学 [M]. 武汉：湖北科学技术出版社, 2005:505505.

　　[3]Sounni NE, Janssen M, Foidart JM, et al. Membrane type1 matrix metalloproteinase and TIMP2 in tumor angiogenesis [J]. Matrix Biol, 2003, 22(1):5561.

　　[4]Neslon AR, Fingleton B, Bothenberg ML, et al. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications [J]. J Clin Oncol, 2000, 18(5):11351149.

　　[5]Thier M, Roeb E, Breuer B, et al. Expression of matrix metalloproteinase2 in glial and neuronal tumor cell lines: inverse correlation with proliferation rate [J]. Cancer Lett, 2000, 149(12):163170.

　　[6]Lu KV, Jong KA, Rajasekaran AK, et al. Upregulatio of tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP)2 promotes matrix mefalloproteinase (MMP)2 activation and cell invasion in a human glioblastoma cell line [J]. Lab Invest, 2004, 84(1):820.

　　[7]Platten M, Wick W, Weller M. Malignant glioma biology: role for TGFβ in growth, motility, angiogenesis and immune escape [J]. Microsc Res Tech, 2001, 52(4):401410.

　　[8]AratoOhshima T, Sawa H. Overexpression of cyclin D1 induces glioma invasion by increasing matrix metalloproteinase activity and cell motility [J]. Int J Cancer, 1999, 83(3):387392.

　　[9]Takahashi M, Fukami S, Iwata, et al. In vivo glioma growth requires hostderived matrix metalloproteinase2 for maintenance of angioarchitecture [J]. Pharmacol Res, 2002, 46(2):155163.