原花青素对局灶性脑缺血大鼠脑组织SOD、MDA和NF-κB的影响

　　作者：刘畅， 张萍， 闵连秋， 贾玉洁，刘学文 作者单位：辽宁医学院第一附属医院神经内科，辽宁 锦州121000;辽宁省兴城中医院，辽宁 兴城125100

　　【摘要】目的 探讨原花青素(Procyanidins，PC)对局灶性脑缺血大鼠神经细胞保护作用及其机制。方法 随机将大鼠均分为假手术组、模型组、PC-1组(50 mg/kg)、PC-2组(100 mg/kg)和PC-3组(200 mg/kg )。以线栓法制备持续性局灶性脑缺血模型，24 h后断头取脑制备组织匀浆测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)及用免疫组化SABC法，统计大鼠海马CA1区每高倍镜视野NF-κB阳性表达率[阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100%]。结果 ①超氧化物歧化酶：PC能明显增强脑组织中超氧化物歧化酶活性，与模型组比较有显著差异[ (50.55±5.87) (U/mg prot)、(51.44±7.06) (U/mg prot)、(55.32±6.39) (U/mg prot)、(39.28±5.67) (U/mg prot)，P<0.01]。②丙二醛含量：PC能明显降低丙二醛含量，与模型组比较有显著差异[(11.73±6.87) (nmol/mg)、(11.13±5.49) (nmol/mg)、(21.54±10.50) (nmol/mg)，P<0.05]，以高剂量组(50 mg/kg)更为显著[(9.96±4.08) (nmol/mg)，P<0.01];③免疫组化显示PC组可以下调NF-κB p65蛋白的阳性表达率，与模型组比较有显著性差异(P<0.01)。结论 ①PC可减少脑缺血后自由基的生成，且以高剂量组的保护作用更加明显;②PC对局灶缺血性脑损伤保护作用的机制可能与抑制NF-кB活性，从而减少细胞凋亡有关。

　　【关键词】 原花青素 超氧化物歧化酶 丙二醛 核因子

　　Effects of Procyanidins on SOD，MDA and NF-кB in Focal Cerebral Ischemia

　　LIU Chang,ZHANG Ping，MIN Lianqiu， JIA Yujie, LIU Xuewen

　　(The Neurological Department of the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001 China;Traditional Chinese Medical Hospital of Xingcheng, Xingcheng 125100 China)

　　Abstract: Objective To study the neuroprotective effects and mechanism of Procyanidins in focal cerebral ischemia injury in rats. Methods Sixty rats were randomly and equally divided into the sham-operative group，model group, focal cerebral ischemia group and Procyanidins groups of 50 mg/kg,100 mg/kg and 200 mg/kg. Embolization thread was inserted into all the rats except those in the sham-operative group for the establishment of model of middle cerebral artery occlusion. 2 week and 1 hours before MCAO，the rats in PC-treatment groups were provided corresponding doses of Procyanidins. The activity of superoxide dismutase (SOD) and contents of malondialdehyde (MDA) were measured after 24 hours focal cerebral ischemia. By immunohistochemical SABC method under high power lens, the immunohistochemistry changes of NF-кB were observed. Results ①The PC groups(50mg/kg，100mg/kg and 200mg/kg)could respectively increase the activity of SOD, which were evidently differential with model group[ (50.55±5.87) (U/mg prot),(51.44±7.06) (U/mg prot),(55.32±6.39) (U/mg prot) and (39.28±5.67) (U/mg prot), P<0.01]. ②The contents of MDA in PC groups were observably reduced[(11.73±6.87) (nmol/mg),(11.13±5.49) (nmol/mg) and (21.54±10.50) (nmol/mg)，P<0.05], especially for the highest dose[(9.96±4.08) (nmol/mg), P<0.01]. ③Immunohistochemistry of NF-κB showed that the positive rates of PC treatment groups are evidently less than that of model group (P<0.01). Conclusions ①Procyanidins can reduce the production of free radicals after cerebral ischemia and the protective function of the group with higher dose is more evident. ②Procyanidins plays a neuroprotective role in the focal cerebral ischemia by decreasing the positive expression of NF-κB and apoptosis.

　　Key words:Procyanidins;SOD;MDA;NF-κB

　　原花青素(Procyanidins，PC)是植物中广泛存在的一种多酚化合物[1]。我们在以前的研究中观察到PC对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用，但其具体作用机制还未完全明确[2]。本实验利用大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO) 模型，通过观察PC对急性脑缺血大鼠的脑组织SOD、MDA及凋亡相关基因蛋白NF-κB p65的表达等的影响，旨在对PC的脑保护作用机制做进一步探讨。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物

　　健康雄性SD大鼠，辽宁医学院动物实验中心提供。许可证号：SCXK(辽)2003-0007。实验动物级别：普通级。

　　1.1.2 药品及试剂

　　PC粉剂(由天津尖峰天然产物研究开发有限公司提供，批号：20040719)用双蒸水制成混悬液。SOD(批号：20041214)、MDA试剂盒(批号：20041206)，由南京建成生物工程研究所提供。NF-κB p65试剂盒均购自武汉博士德生物试剂公司。

　　1.1.3 实验仪器

　　JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机，上海新生物技术研究所;TGLL-18g台式高速冷冻离心机，太仓市医疗器械厂。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组

　　将健康SD大鼠60 只，随机平均分为5组：分别为假手术组、模型组和PC-1组、2组、3组。PC-1组、2组、3组分别于术前2 周及术前1 h灌胃PC混悬液50 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)、200 mg/(kg·d)。假手术组和模型组：于术前2 周及术前1 h灌胃等量的生理盐水。

　　1.2.2 大鼠局灶性脑缺血模型的制备

　　以线栓法[3]制作大鼠MCAO模型。10%的水合氯醛(0.3 mL/100 mg)腹腔注射麻醉大鼠后，分离右颈总动脉并剪一小口，将头端烧成光滑杵状的国产尼龙线(直径0.235 mm，长6 cm)插入，以颈总动脉分叉处计算进线深度为(18±0.5)mm，至大脑中动脉起始部以完全阻断血供。模型成功的标志是大鼠即刻出现右侧Horner征。假手术组除不插入线栓外，其它操作步骤同上。

　　1.2.3 脑组织中SOD活性及MDA含量的测定

　　大鼠术后24 h予以20%乌拉坦(0.5 mL/100g)麻醉，快速断头取脑。去除低位脑干及嗅束，用生理盐水冲洗脑表面血液， 滤纸吸干表面水分，剥除软脑膜，取右侧大脑半球。以重量(g)/体积(mL)比1∶9加入0.9%的冰生理盐水用超声波细胞粉碎机制成匀浆，冷冻离心机离心15 min(3000 r/min)，取上清液0.05 mL。分别采用黄嘌呤氧化法、硫代巴比妥显色(TBA)法和考马斯亮蓝蛋白测定法测定SOD、MDA和匀浆蛋白量。严格按说明书操作。

　　1.2.4 计算大鼠脑组织海马CA1区NF-κB p65蛋白阳性表达的细胞率

　　术后24 h大鼠脑组织用4%多聚甲醛局部灌流内固定，然后迅速取脑。自额叶至枕叶分为A、B、C、D、E 5等份，取C脑片[4]常规酒精脱水，石蜡包埋，制成5 μm厚的切片。将其进行免疫组化SABC法染色，严格参照武汉博士德生物试剂公司说明书操作。

　　每个大鼠脑取1张切片，于每张切片缺血侧海马CA1区取3 个高倍镜视野(10×40)共18个视野，胞核有棕色颗粒者为阳性细胞，用CIAS-1000型高清晰度彩色病理图文分析系统分析计算每个高倍镜视野阳性细胞表达率(阳性细胞数/阳性细胞数+阴性细胞数)×100%。

　　1.2.5 统计学处理

　　数据均用±s表示。多组间比较采用单因素方差分析检验，两组间比较采用LSD-t检验。

　　2 结果

　　2.1.1 PC对局灶性脑缺血大鼠脑组织中SOD活性和MDA含量的影响

　　PC各剂量组均能明显增强脑组织中SOD活性，与模型组比较有显著差异[ (50.55±5.87)、(51.44±7.06)、(55.32±6.39)，(39.28±5.67)，P<0.01]。PC低、中剂量组均能明显降低MDA含量，与模型组比较有显著差异[ (11.73±6.87)、(11.13±5.49)，(21.54±10.50)，P<0.05]，以高剂量组(200 mg/kg))更为显著[(9.96±4.08)，P<0.01]。

　　表1 不同剂量PC对MCAO大鼠脑组织中SOD活性及 MDA含量的影响(略)

　　注:与假手术组比较，▲▲P<0.01;与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01;NS：0.9%生理盐水

　　2.1.2 PC对局灶性脑缺血大鼠脑NF-κB p65蛋白表达的影响

　　本实验结果显示(如图1)：①各组NF-κB p65在大脑广泛区域均有阳性表达，但假手术组表达较少，免疫阳性反应主要位于胞浆;②较假手术组(见图1a)相比，模型组(见图1b)阳性细胞表达率显著增多[(9.32±3.65)%、(54.47±5.58)%, (P<0.01)]，光镜下观察胞核呈棕褐色，苏木素不能复染;③原花青素低、中和高剂量组(见图1c、图1d、图1e)NF-κB p65蛋白阳性细胞率明显低于模型组(P<0.01);④PC高剂量组NF-κB p65蛋白表达明显低于低剂量组(P<0.05)。

　　表2 不同剂量PC对MCAO大鼠海马CA1区NF-κB蛋白表达的影响(略)

　　注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01;与PC-1组比较，▲P<0.05;NS：0.9%生理盐水

　　3 讨论

　　3.1 PC可以增强脑组织中SOD的活性和降低MDA含量，具有清除氧自由基的作用

　　自由基蓄积可引起细胞严重的功能障碍甚至死亡，神经细胞对自由基损伤尤为敏感。MDA是氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的稳定代谢产物，测定MDA含量间接反映脑组织中氧自由基水平和脂质过氧化反应的强弱。

　　本实验发现：与假手术组比较，模型组大鼠脑组织MDA含量升高，表明机体发生了氧化应激反应，导致脂质过氧化作用增强，而且机体清除自由基的能力下降。PC组能明显降低MDA的活性(P<0.05)，高剂量组尤为明显(P<0.01)，表明PC通过清除自由基、抗氧化作用保护细胞膜和细胞器膜结构的完整性，减少自由基对DNA的损伤，从而减少了细胞坏死，同时也可能通过间接途径抑制凋亡相关基因的表达而抑制凋亡。PC的抗氧化作用可能与其丰富的酚羟基有关。

　　SOD是机体内清除氧自由基的特异酶。预先给以PC可对抗脑组织和神经元损伤表现，增强SOD的活性 (P<0.05或P<0.01)，提示PC可能主要通过增强SOD活性而提高线粒体的抗氧化能力，从而减少线粒体氧化应激所致的能量耗竭，发挥神经保护作用。本实验结果提示PC高剂量组增强SOD活性优于低、中剂量组 (P<0.05)，显示出剂量依赖性。

　　3.2 PC对MCAO后凋亡相关基因NF-κB的影响

　　NF-κB属于Rel蛋白家族，是一种广泛存在于中枢神经系统中，能将信息从胞浆传至胞核引起相应基因表达的重要转录因子[5]。NF-kB通常是指p50/p65蛋白组成的二聚体，静息状态下与抑制蛋白I-κBα结合成无活性的形式存在于胞质中，激活状态下，I-κBα被磷酸化、降解，从而使Rel蛋白的核定位信号及p65亚基暴露，导致NF-κB快速移至核内，与特异的启动子结合，调控许多靶基因的转录[6]。

　　脑缺血损伤时，NF-kB被氧自由基、细胞因子、钙超载等因素刺激而活化，多数学者认为，NF-κB可以通过调控多种凋亡相关基因的表达引起神经细胞的损伤[7-12]。本实验显示：假手术组大鼠海马区有基础水平的NF-κBp65表达，但主要位于胞浆内，考虑为非活性表达。模型组阳性表达率则显著增加，与Baeuerle 等的研究一致[13]。提示PC可能通过其抗氧化、抗炎作用而抑制NF-κB的活化，进而抑制缺血后神经细胞的凋亡，而发挥其保护作用。PC低、中、高剂量组NF-κB p65蛋白表达有升高趋势，且PC高剂量组明显低于低剂量组(P<0.05)，提示剂量依赖性。

　　(此文图1见附页7)(略)

　　【参考文献】

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